2023學(xué)年完整公開(kāi)課版病毒的復(fù)制

作物生產(chǎn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)/教學(xué)資源庫(kù)病毒的復(fù)制一、噬菌體的分類(lèi)多數(shù)噬菌體可以按照其形態(tài)分為以下四類(lèi)：無(wú)尾二十面體型收縮尾型（結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，例如E.coli的T偶數(shù)噬菌體）非收縮尾型絲狀噬菌體噬菌體分類(lèi)的依據(jù)：宿主種類(lèi)、免疫學(xué)關(guān)系等。但目前最主要的分類(lèi)依據(jù)還是噬菌體的形態(tài)和核酸特性。

噬菌體的遺傳物質(zhì)可以是DNA，也可以是RNA，已知的大部分噬菌體的遺傳物質(zhì)是dsDNA。核酸形態(tài)噬菌體的復(fù)制周期裂解性生活周期：DNA噬菌體在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制后，宿主細(xì)胞裂解并釋放新噬菌體。（E.coli的T偶數(shù)噬菌體）（一）雙鏈DNA噬菌體的復(fù)制

1.一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

1）將適量噬菌體接種于培養(yǎng)好的高濃度敏感細(xì)胞中，使每個(gè)敏感細(xì)胞至多只能吸附到一個(gè)噬菌體。2）使已吸附的噬菌體建立同步感染（稀釋或抗體沉淀）3）繼續(xù)培養(yǎng)，定時(shí)取樣，測(cè)定樣品中病毒的滴度。

病毒的滴度（titer），又稱(chēng)效價(jià)，是指每毫升樣品中含有的侵染性病毒粒子的數(shù)量。(雙層平板法測(cè))

以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒滴度為縱坐標(biāo)，繪制定量描述烈性噬菌體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱(chēng)為一步生長(zhǎng)曲線。潛伏期：是從噬菌體吸附于宿主細(xì)胞表面到子代噬菌體釋放所需的最短時(shí)間。包括：隱蔽（晦）期和胞內(nèi)積累期。裂解量：是每個(gè)受侵染的細(xì)胞所產(chǎn)生的子代噬菌體的數(shù)目。兩個(gè)重要參數(shù)2.噬菌體的復(fù)制過(guò)程（烈性噬菌體的裂解周期）（1）吸附和侵入受體（吸附）位點(diǎn)：細(xì)胞壁上的脂多糖、蛋白質(zhì)、磷壁酸，以及鞭毛和菌毛

附著固著尾部收縮刺入細(xì)胞DNA注入T4噬菌體吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程：如果大量噬菌體在短時(shí)間內(nèi)吸附于同一細(xì)胞上，使細(xì)胞壁產(chǎn)生許多小孔，也可引起細(xì)胞立即裂解，但并未進(jìn)行噬菌體的增殖，這種現(xiàn)象稱(chēng)為自外裂解（lysisfromwithout）。（2）噬菌體大分子的合成早期mRNA

：宿主RNA聚合酶開(kāi)始合成的病毒mRNA，即噬菌體DNA復(fù)制前轉(zhuǎn)錄的mRNA。早期蛋白：早期mRNA翻譯成的蛋白，這些蛋白將接管宿主細(xì)胞并合成病毒核酸。其中一些酶將宿主DNA降解成核苷酸，為病毒DNA的合成提供原料；一些蛋白對(duì)宿主細(xì)胞RNA聚合酶進(jìn)行修飾，使其識(shí)別病毒的DNA啟動(dòng)子，開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成中期mRNA。中期mRNA：即病毒DNA復(fù)制所需的酶的mRNA。

噬菌體DNA注入宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞自身的DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成便會(huì)中止，轉(zhuǎn)而合成病毒復(fù)制所需的成分。中期蛋白：中期mRNA翻譯成的蛋白(DNA復(fù)制所需的酶、羥甲基胞嘧啶合成酶以及晚期mRNA聚合酶等)，病毒DNA開(kāi)始復(fù)制(某些堿基的修飾是抵制宿主的限制)。多聯(lián)體----合成的T4噬菌體DNA具有末端冗余(重復(fù)的一段堿基序列)，大約6-10個(gè)克隆通過(guò)末端冗余序列連接在一起，這種由若干單元同向相連形成的超長(zhǎng)鏈DNA稱(chēng)為多聯(lián)體，多聯(lián)體在裝配過(guò)程中被切割。晚期mRNA：DNA復(fù)制完成后合成的mRNA(指導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白、裝配蛋白、溶菌酶等)。晚期蛋白：噬菌體的結(jié)構(gòu)蛋白、裝配蛋白、溶菌酶等這些細(xì)胞裂解期間合成的蛋白質(zhì)。（3）噬菌體的裝配

T4噬菌體的裝配是一個(gè)極為復(fù)雜的自我裝配的過(guò)程。大致分為4個(gè)獨(dú)立的途徑：1）頭部殼體裝入DNA形成成熟的頭部2）由基板、尾管、尾鞘組裝成無(wú)尾絲的尾部；3）頭部與尾部自發(fā)結(jié)合；4）裝上尾絲頭部衣殼粒DNA衣殼尾部尾鞘噬菌體尾絲（4）噬菌體的釋放37℃培養(yǎng)時(shí)，侵染約22分鐘后，E.coli發(fā)生裂解并釋放約300個(gè)T4噬菌體。這一過(guò)程需要一些T4基因的支持：一種基因指導(dǎo)溶菌酶的合成，溶菌酶可以攻擊細(xì)胞壁的肽聚糖；另一種噬菌體蛋白稱(chēng)為holin，它可破壞細(xì)胞膜，使溶菌酶到達(dá)并破壞細(xì)胞壁，同時(shí)阻止細(xì)胞膜上的能量代謝反應(yīng)。二、溫和性噬菌體和溶源性1.烈性噬菌體（virulentphage）：

感染宿主細(xì)胞后能在細(xì)胞內(nèi)正常復(fù)制并引起宿主細(xì)胞迅速裂解的噬菌體。2.溫和噬菌體（temperatephage）：

感染宿主細(xì)胞后，噬菌體基因組長(zhǎng)期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)（整合于宿主的基因組上或以質(zhì)粒形成獨(dú)立存在），并隨宿主基因組的復(fù)制而同步復(fù)制，沒(méi)有成熟噬菌體產(chǎn)生，不引起宿主細(xì)胞裂解的噬菌體。

這種噬菌體與宿主之間的關(guān)系稱(chēng)為溶源性（lysogeny）。凡能引起溶源性的噬菌體稱(chēng)為溫和噬菌體，其宿主稱(chēng)為溶源菌。溫和噬菌體的存在形式有3種：游離態(tài)：前噬菌體所攜帶的遺傳信息由于受噬菌體本身編碼的一種特異阻遏物的阻遏作用而得不到表達(dá)，因此不進(jìn)行DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成。但隨宿主菌基因組的復(fù)制而同步復(fù)制。營(yíng)養(yǎng)態(tài)：整合態(tài)：指成熟后被釋放并有侵染性的游離噬菌體粒子已整合到宿主基因組上的噬菌體核酸，稱(chēng)為前噬菌體（prophage）。指前噬菌體經(jīng)外界理化因子誘導(dǎo)后，脫離宿主核基因組而處于積極復(fù)制、合成和裝配的狀態(tài)溫和噬菌體的溶源性反應(yīng)：（參見(jiàn)P82）整合于細(xì)菌染色體或以質(zhì)粒形成存在的溫和噬菌體基因組稱(chēng)做原噬菌體（prophage）細(xì)胞中含有以原噬菌體狀態(tài)存在的溫和噬菌體基因組的細(xì)菌稱(chēng)做溶源性細(xì)菌（lysogenicbacteria）λ噬菌體的的溶源性反應(yīng)：

進(jìn)入宿主后線狀基因組依靠粘性末端環(huán)化λ噬菌體以大腸桿菌K12為宿主了解最充分的一種溫和噬菌體，dsDNA，頭部為二十面體，非收縮性長(zhǎng)尾。λ噬菌體的的溶源性反應(yīng)：基因組的表達(dá)與復(fù)制存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性λ噬菌體基因組有40多個(gè)基因，大多數(shù)基因根據(jù)功能不同聚集在一起，分別涉及頭部合成、尾部合成、溶源性及調(diào)控、DNA復(fù)制和細(xì)胞裂解。λ噬菌體的溶源性反應(yīng)：通過(guò)特定位點(diǎn)（att位點(diǎn)）以線狀形式整合進(jìn)大腸桿菌半乳糖操縱子和生物素操縱子之間，成為原噬菌體。

對(duì)于溶源性來(lái)說(shuō)，整合并非絕對(duì)需要。大腸桿菌噬菌體P1在溶源菌中以獨(dú)立的環(huán)狀DNA分子存在，并與宿主染色體同步復(fù)制。3.溶源菌（lysogen或lysogenicbacteria）含有λ噬菌體基因組的大腸桿菌，表示：E.coliK12(λ)溶源菌的檢測(cè)方法：

法1：少量溶源菌+大量敏感指示菌+肉湯瓊脂培養(yǎng)基

特殊噬菌斑（中央溶源菌菌落，周?chē)该鳎┓?：溶源菌經(jīng)uv照射，進(jìn)一步培養(yǎng)，濾去培養(yǎng)物中活細(xì)菌，將濾液與敏感菌混合培養(yǎng)，形成透明噬菌斑。溶源菌的特性：1）遺傳特性（溶源菌產(chǎn)生的子細(xì)胞一般也是溶源菌）；2）可自發(fā)裂解（10-2~10-5）；3）可誘導(dǎo)裂解（uv，x-射線，絲裂霉素C，氮芥）；4）免疫性（溶源菌對(duì)超感染具有“免疫性”，即另一個(gè)同類(lèi)噬菌體不感染該溶源菌，有時(shí)雖然可再次感染該溶源菌，但其核酸不能復(fù)制和表達(dá)。而溶源菌可同時(shí)被非同源噬菌體感染，表現(xiàn)出雙重溶源性。免疫性是由原噬菌體產(chǎn)生阻遏蛋白的可擴(kuò)散性質(zhì)決定的。）5）復(fù)愈性（10-5，喪失其前噬菌體，變?yōu)榉侨茉淳?）溶源轉(zhuǎn)變(lysogenicconversion)

，溶源菌有時(shí)還能獲得新的生理特性（原噬菌體引起的溶源菌除免疫性以外的其他表