2023學(xué)年完整公開課版薄層掃描法

中藥制劑分析技術(shù)薄層色譜掃描法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine

1.定義薄層掃描法是供試品經(jīng)薄層分離后,用一束波長(zhǎng)、強(qiáng)度一定的紫外線或可見(jiàn)光對(duì)薄層板進(jìn)行掃描，通過(guò)測(cè)定薄層板上的斑點(diǎn)對(duì)光的吸收強(qiáng)度或斑點(diǎn)經(jīng)激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行定量的方法。

2.特點(diǎn)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離快速、靈敏度及分辨率高、顯色劑選擇范圍廣、適用于多組分及微量組分定量等。薄層掃描法

一、儀器工作原理（一）薄層色譜掃描法的基本原理薄層色譜掃描法的測(cè)定原理是用長(zhǎng)寬可以調(diào)整的一束波長(zhǎng)、強(qiáng)度固定的光，對(duì)薄層板上的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，通過(guò)測(cè)量斑點(diǎn)或被斑點(diǎn)反射的光束的強(qiáng)度變化，求出待測(cè)組分含量。薄層掃描法可分為吸收薄層掃描法和薄層熒光掃描法。薄層掃描法

1.吸收薄層掃描測(cè)定法

是用可見(jiàn)-紫外光的單色光對(duì)薄層板上色譜斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，根據(jù)掃描獲得的吸光度隨展開距離變化的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行定量的方法。根據(jù)測(cè)光的方式不同，吸收掃描測(cè)定法又分為透射法和反射法兩種。

透射法是測(cè)定光透過(guò)供試品斑點(diǎn)后的吸收情況進(jìn)行的定量方法透射法掃描

L-光源MC-單色器P-薄層板S-斑點(diǎn)PD-檢測(cè)器薄層掃描法反射法是測(cè)定供試品斑點(diǎn)對(duì)光的反射情況進(jìn)行的定量方法。L-光源MC-單色器P-薄層板S-斑點(diǎn)PD-檢測(cè)器反射法掃描

薄層掃描法吸光度與物質(zhì)的濃度及液層厚度間不呈線性關(guān)系的解決方法選擇曲線中的直線部分進(jìn)行定量分析采用Kubelka-Munk方程利用非線性方程定量薄層掃描法

2.薄層熒光掃描法

是通過(guò)儀器對(duì)供試品吸收可見(jiàn)-紫外光后發(fā)射的熒光強(qiáng)度掃描得到的吸收光譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)，求出供試品含量的方法。熒光反射法掃描L-光源MC-單色器P-薄層板S-斑點(diǎn)PD-檢測(cè)器薄層掃描法當(dāng)樣品量很少時(shí)，斑點(diǎn)中組分的濃度與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系，可按公式計(jì)算：F=2.3K/IoECL或F=KC式F=2.3K/IoECL中：F為熒光強(qiáng)度；Io為入射光強(qiáng)度；C為濃度；E為吸收系數(shù)；K為常數(shù)（與熒光效率有關(guān)）；L為薄層厚度。式F=KC中：C為濃度；

K為2.3K/IoEL之積。在薄層熒光掃描法中，常用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值（色譜峰面積）代替公式中的F，斑點(diǎn)中組份的含量代替公式中的C進(jìn)行計(jì)算。薄層掃描法（二）薄層掃描儀的構(gòu)造薄層掃描儀主要由主機(jī)（光源、單色器、供試品室、薄層板臺(tái)架、檢測(cè)器）及工作站組成。

1.光源包括紫外光源氘燈（200nm～370nm）；可見(jiàn)光源鎢燈（370nm～700nm）；熒光光源氙燈或汞燈（200nm～700nm），其中汞燈為線光源，可提供特征輻射光譜。薄層掃描法

2.單色光器單色光器可以將光源發(fā)出的連續(xù)光分解為單色光。其主要由入射狹縫、出射狹縫、色散元件、平行光裝置（準(zhǔn)直鏡）等部分構(gòu)成。薄層掃描儀多采用光柵為色散元件。

3.薄層板臺(tái)包括薄層板臺(tái)架及驅(qū)動(dòng)裝置。

4.檢測(cè)器檢測(cè)器是用來(lái)檢測(cè)和放大由供試品斑點(diǎn)透射、反射或發(fā)出熒光強(qiáng)度的裝置。

5.工作站具有設(shè)定儀器參數(shù)、控制儀器工作條件和信號(hào)采集、處理計(jì)算和打印輸出等功能的裝置。薄層掃描法（三）儀器性能的檢定

1.波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的檢查一是利用汞燈的特征光譜線對(duì)儀器的波長(zhǎng)進(jìn)行準(zhǔn)確度檢查。二用氘燈以反射方式對(duì)硅膠G的薄層板上的10mg/ml的磷酸氯喹水溶液斑點(diǎn)做光譜掃描，如在257±10nm和343±10nm有最大吸收峰，則準(zhǔn)確度符合要求。

2.重復(fù)性測(cè)定系指同一薄層板上、同一供試品溶液相同濃度的數(shù)個(gè)斑點(diǎn)，掃描結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以峰面積的積分值計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。鋸齒掃描的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤1.5%，線性掃描的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)≤2.0%.薄層掃描法（四）薄層掃描儀的工作流程

1.吸收薄層掃描法的薄層掃描儀工作原理

以CS-9301PC型雙波長(zhǎng)掃描儀為例。薄層掃描儀的光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖薄層掃描法2.薄層熒光掃描法的薄層掃描儀工作流程

以島津CS-9000型雙飛點(diǎn)掃描儀為例。

CS-9000型儀器的光學(xué)系統(tǒng)薄層掃描法二、含量測(cè)定（一）概述

1.原理

薄層掃描法含量測(cè)定有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法兩種方法，中國(guó)藥典僅采用外標(biāo)法。2.類型

根據(jù)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線性質(zhì)的不同，外標(biāo)法又分為外標(biāo)一點(diǎn)法和外標(biāo)兩點(diǎn)法。薄層掃描法測(cè)定方式

供試品選擇檢測(cè)方法

含量計(jì)算薄層掃描法含量測(cè)定操作步驟溶液的制備薄層板點(diǎn)樣展開掃描掃描波長(zhǎng)對(duì)照品系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

掃描方式薄層掃描法（二）操作步驟和方法

1.測(cè)試溶液的制備2.薄層色譜操作外表一點(diǎn)法和外標(biāo)二點(diǎn)法的點(diǎn)樣操作。（1）外標(biāo)一點(diǎn)法（2）外標(biāo)兩點(diǎn)法外標(biāo)兩點(diǎn)法點(diǎn)樣方法薄層掃描法

3.展開

4.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

（1）靈敏度的檢測(cè)（2）分離度（3）重復(fù)性

5.上機(jī)掃描（1）檢測(cè)方法選擇（2）測(cè)定方式選擇:反射法和透射法（3）掃描波長(zhǎng)選擇：

①單波長(zhǎng)掃描法；②雙波長(zhǎng)掃描法;③薄層熒光掃描波長(zhǎng)的選擇單波長(zhǎng)、單光束掃描儀光路圖單波長(zhǎng)、雙光束掃描儀光路圖

薄層掃描法（4）掃描方式的選擇：①直式掃描（線性掃描)；②鋸齒掃描（飛點(diǎn)掃描）；③圓形掃描；④傾斜掃描。掃描時(shí)，應(yīng)自下而上掃描，不可橫向掃描。掃描光束（點(diǎn)）的形狀和大小，可通過(guò)調(diào)整狹縫的高度和寬度實(shí)現(xiàn)。線性掃描圖

薄層掃描法鋸齒掃描

薄層掃描法6.含量計(jì)算

（1）外標(biāo)一點(diǎn)法：標(biāo)準(zhǔn)曲線通過(guò)原點(diǎn)。計(jì)算公式：C=F1·A

（2）外標(biāo)兩點(diǎn)法(隨行標(biāo)準(zhǔn)法)：標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過(guò)原點(diǎn)。計(jì)算公式：C=F1·A+F2

由C1=F1·A1+F2C2=F1·A2+F2得7.結(jié)果判斷將測(cè)定結(jié)果與2010年版《中國(guó)藥典》中的各品種項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，符合標(biāo)準(zhǔn)即為合格。8.注意事項(xiàng)

薄層掃描法三、案例（一）靈寶護(hù)心丹的含量測(cè)定供試品溶液的制備對(duì)照品溶液的制備薄層掃描含量計(jì)算本品每1g含牛黃以膽酸（C24H40O5）計(jì)，不得少于2.5mg。靈寶護(hù)心丹的膽酸含量測(cè)定采用的是何種方法？供試品溶液是如何制備的？課堂互動(dòng)薄層掃描法（二）計(jì)算舉例用薄層吸收掃描法測(cè)定黃連中小檗堿含量，由方法學(xué)考察證明工作曲線過(guò)原點(diǎn)。現(xiàn)進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)，在同一薄層板上，分別取濃度為2.00μg/μl對(duì)照品溶液和供試品溶液（取生藥黃連0.3000g，提取后定容為10.00ml）點(diǎn)樣，點(diǎn)樣體積為2μl，由薄層掃描儀測(cè)得峰面積為AR=58541.80，AX=78308.3，計(jì)算黃連中