上海市臨檢中心 數字PCR培訓課件 4 婁加陶-數字PCR在外周血T790M檢測中的運用重慶

數字PCR檢測外周血T790M的運用婁加陶上海市胸科醫(yī)院肺癌治療策略的變革PreciseTherapyClinicalPathologyMolecularOnocologyMolecularDiagnosticsOnocologyDiseaseGuidedOnocologyPathologyGuidedLess

choices：SurgeryIncreasedtherapeuticoptionsThemutations

ofdriver

genes

astargetsRadiotherapyaccording

todifferent

tumortypesChemotherapyPresented

ByEnriqueta

Felipat2015

ELCC;臨床的問題和需求再活檢和動態(tài)監(jiān)測困難沒有足夠的腫瘤組織腫瘤異質性（時間和空間）侵襲性→非侵襲性→靜態(tài)

動態(tài)→單基因

多基因靶向耐藥不可避免T790M突變是主要的耐藥機制Yu

H

Aet

al.ClinCancerRes2013;19:2240-2247T790M組織檢測的空間異質性30位TKI耐藥后接受多位點再次活檢患者的T790M狀態(tài)BiopsySite1T790M

BiopsyT790MPatients◆/

◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆

◆◆

Site2◆/

◆◆

◆

◆◆

Patient

1Patient

2Patient

3Patient

4Patient

5Patient

6Patient

7Patient

8LungtumorLungtumorLungtumorBraintumorBraintumorCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSFCSF其中22例匹配的胸部和腦部標本Pleural

effusionPleural

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effusionLungtumor胸部總計腦部+2-+-02Patient

9Patient

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30101210

2010

22總計LungtumorLungtumorLungtumor一致性

:12/22（55%）Pleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionPleural

effusionClavicularLNLungtumorLung(primary)LungtumorLungtumorCSFCSFCSFCSFAkitoHata,et

al.JTO,

2015CSFPleural

effusionLung(meta)Pleural

effusionPleural

effusionSkintumorPleural

effusionClavicularLNPericardialeffusionAbdominalLNLungtumorLungtumorLungtumorT790M組織檢測的時間異質性24例(12例胸部、6例CSF，6例胸水)使用TKI前后均檢測T790M突變狀態(tài)5位患者停止

TKI

治

療一段時間后，T790M

狀

態(tài)從陽性變成陰性實時監(jiān)測的必要性！1位患者在接受高劑量的厄洛替尼后腦脊液的T790M

由

陰性轉陽性?

×

?:代表接受TKI治療；?：代表停止TKI治療A

：阿法替尼；III

：三代TKI；B

：貝伐單抗；H-E：高劑量erlotinib；G：易瑞沙AkitoHata,et

al.JTO,

2015耐藥T790M突變檢測挑戰(zhàn)？

373例初治的患者，298例患者存在T790M突變，比例高達約80%

突變豐度<1%的患者比例為98%，突變豐度>1%的患者比例僅為2%；高靈敏度檢測方法的必要性！Masaru

etal,ClinCancer

Res(2015)二、如何做？1、樣本來源多種樣本的獲取方式和優(yōu)缺點1.

組織活檢（腫瘤蠟片）2.細胞學標本（惡性胸水）3.血液標本（ctDNA)樣本品質和腫瘤細胞含量可能比組織樣本較低當無法獲取組織或細胞學樣本時，作為有效補充過往的檢測金標準DNA

片段/假陰性較多，需要高敏感度方法-+-+-侵入性每個病人都適用++--動態(tài)檢測對于組織和胸水都取不到的患者，血液樣本是一個很好的補充Pirker

Retal.JThorac

Oncol2010;

Savic

Setal.BrJCancer

2008;

Rekhtman

Netal.JThoracOncol2011;Tanaka

Tetal.CancerSci2007組織/細胞學檢測是目前的金標準，但仍有局限部分患者無組織標本或無足夠的組織標本進行基因檢測由于腫瘤異質性，重復活檢和動態(tài)檢測困難僅根據初診時標本指導后續(xù)治療可能產生偏倚1.

Pirker

Ret

al.

JThoracOncol2010;5:1706–1713;2.

MarchettiAand

Normanno

N.Patholgica

2010;102:119–122;3.

Eberhard

Detal.

JClinOncol2008;26:983–994;4.

KimuraHet

al.

BrJCancer

2006;95:95:1390–1395;5.

OshitaFetal.

BrJCancer

2006;95:1070–1075;血液檢測的優(yōu)勢指導用藥勻質標本實時監(jiān)測作為無法獲取組織標本的補充，無創(chuàng)取樣后的檢測結果指導臨床用藥循環(huán)而勻質的血液標本，在一定程度有效克服異質性實現實時動態(tài)監(jiān)測，提高全程管理水平1.

Molina-VilaMetal.

JThoracOncol2008;3:1224–1235;2.Smouse

Jetal.

Cancer

Cytopathol2009;117:67–72;3.

VanEjikRet

al.

PLoSOne2011;6:e177791;4.

Rekhtman

Net

al.

JThoracOncol

2011;6:451–458EGFR基因突變血液檢測共識2014年歐洲藥品管理局：當難以獲取腫瘤組織樣本時，可采集外周血作為補充標本評估EGFR基因突變，以明確吉非替尼治療中受益的患者2015年《NSCLC血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》：腫瘤組織仍是優(yōu)先選擇的生物樣本，但難以獲取時血液可作為合適的替代生物材料《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》.中華醫(yī)學雜志,

2015.二、如何做？2、檢測平臺血液EGFR檢測方法技術手段ARMS第二代ARMS

（superARMS）Nestedreal-timePCRDropletDigitalPCRMicrofluidicDigitalPCRCOLD-ddPCRNanofluidicDigitalPCRBEAMingDigitalPCRcastPCR（Competitive

AlleleSpecific

TaqMan

PCR）Clamping

PCRSynchronous

TES（thermal-electrophoreticseparation）NGSInt.

J.

Mol.Sci.2015,

16,14122-14142ARMS,

digital

PCR,NGS的比較ARMSDigital

PCRNGS單一基因/已知突變位點單一基因/知突變位點已

多個基因/測序長短可知或未知突變位點<5%(依照檢檢測靈敏度下限數據能否量化試驗操作難度數據解讀難度報告準備時間是否已批準上市1-5%<0.1%可量化++測序列不同而異)半定量標準基線校正)(需有可量化+++++++++(專業(yè)實力差距大)2-3周2-3天+3-4天伴隨診斷VVVV動態(tài)監(jiān)測V(需有標準基線校正)V臨床應用新靶點探尋耐藥機制探尋病人生物標記物VV單一靶點單一靶點多靶點ARMS-PCR儀器平臺------適用多種主流的熒光定量PCR儀器試劑盒----

組織血液均獲批，適用樣本類型多（新鮮組織，石蠟組織，胸水，血液）靈敏度：對同一份突變含量低至1%的DNA樣品進行10次重復，均能檢出試劑盒名稱是否獲批用途及特點組織CFDA和CE認證ADx-EGFR

mutationCFDA和CE認證ADx-EGFR

mutationin

ctDNA血液ADx-SuperARMS尚未獲批單點T790M檢測DropletDigitalPCR整體原理：“分而治之”（divide

and

conquer），靈敏度高，適合稀有DNA片段檢測DilutionDistribution

Amplification

QuantificationNGSctDNA提取及質量檢測文庫制備及質量控制測序文庫質量檢測測序及數據分析NGS和ddPCR都能夠報告等位基因突變頻率，反映不同亞克隆的比例關系NGS和ddPCR都是通過計算，看檢測出多少帶有突變的DNA（突變型），和檢測到的所有的DNA（野生型+突變型）的比值來確定等位基因突變頻率（AF）。?

等位基因突變頻率=4/14=28.5%?

未突變的DNA來自正常組織或腫瘤中的其他亞克隆EGFR

L858通過等位基因突變頻率在結合樣本病理評估中的腫瘤細胞占比，我們能夠對腫瘤內部帶有不同驅動基因的腫瘤細胞亞克隆有一個大致的比例上的了解。對了解腫瘤異質性有幫助。NGS能夠覆蓋傳統(tǒng)方法和ddPCR無法檢測的突變種類?

MET14exon

skipping，HER2

20exon

insertion等情況復雜的突變?

EGFR等熱點基因的非熱點突變位點?

ALK等熱點基因的非常見融合方式?

罕見的EGFR-19Del

可能會造成PCR方法假陰性約3/4

ALK融合為經典的EML4-ALK融合，但有1/4為與其他基因的融合，包括：?

STRN-ALK?

CATSPERB-ALK?

ACVR1-ALK?

CLIP1-ALK?

DPH6-AS1-ALK?

KIF5B-ALK?

RP11-320M2.1-ALK?

UGP2-ALK二、如何做的準？自建系統(tǒng)性能確認實驗室自建分子診斷項目的基本要求(2016)準確性實驗室資質及環(huán)境精確性監(jiān)管實驗室人員要求實驗室管理要求參考范圍可報告范圍分析靈敏度性能確認性能確認質量控制試劑耗材質量室內質控、室間質評分析特異性臨床驗證中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會分子診斷專家委員會：《實驗室自建分子診斷項目基本要求專家共識》血液EGFR基因突變檢測流程微滴閱讀結果分析生成微滴PCR擴增血漿分離（兩次離心）4℃

1600g

10min4℃

16000g

10minQX200?

Droplet

Digital?

PCR

系統(tǒng)樣本檢測核酸抽提QIAampCirculatingNucleic

AcidKit（55114）PCR反應體系配置ddPCRTM

Supermixfor

Probes;PrimePCRTMddPCRTM

MutationAssayQCQuibit

3.0分析前質量控制-樣本處理方法：選擇早期和晚期臨床肺癌患者各3例，2h內分離血漿，每個病人血漿均分成2mL的4等份，以4個不同公司的試劑盒進行血漿游離DNA抽提，qubit比較其濃度，2100檢測相應的純度。公司A公司BctDNA濃度比較公司A公司B10008006004002000公司C公司D公司C公司D不同臨床分期的血漿樣本早3血漿抽提2100檢測cfDNA條帶分布空白檢測限(LOB)方法：對20名健康人外周血3個EGFR基因位點（19del、T790M、L858R）突變情況進行檢測，結果突變微滴數目均在0-1之間，利用檢測結果繪制泊松分布圖，并以其95%置信區(qū)間上限作為參考上限，設定空白檢出限。陽性判斷標準：

ch1+ch2-

微滴數≥21

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.20

.019-Del1

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.0LOB=1LOB=1024681

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2024681

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tsIn

Submission準確性64例晚期非小細胞肺癌血漿樣本與ddPCR結果與NGS比較：一致性良好。NGSConcordanddPCRKappay=0.3827x+0.0106R2=0.8894+—ce（%）0

.30

.20

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.0+—+111250119-DelsL858RT790M95.310.8510.9130.93814196.8898.44—+4800

.20

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P

CR—154Guo

qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission精密度方法：選取高低2個濃度標準品（突變比例分別為1%、0.1%），每天測定3次，連續(xù)5天進行精密度評估，精密度小于15%視為符合要求。1%標準品0.1%標準品19-Dels5.91%L858RT790M19-DelsL858RT790M3.52%8.60%9.80%8.61%14.63%批內精密度（%）批間精密度（%）12.34%12.44%12.33%14.12%14.74%8.65%線性范圍方法：以野生型A549細胞系DNA對突變型細胞系DNA進行稀釋，制備突變比例為50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%和0.01%的標準反應模板，得到的結果以預期結果作橫坐標，以實際觀測結果為縱坐標，做線性評估，回歸系數R2>0.99可判斷為線性。1

9

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)Guo

qiaomei,

etal,Oncotarget,insubmission分析靈敏度方法：將1%突變比例的標準品采用野生型標準品依次稀釋為0.05%、0.1%、0.5%、1%的梯度，每個位點每種突變比例下設置20個反應。要求CV%<20%。（nX

-

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1CV（%）=α/Xmean

×100%CV(%)19-DelL858RT790M1%0.5%13.2114.6412.160.1%16.4314.5213.020.05%19.1214.5636.197.37.9910.50

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)InSubmission分析特異度突變比例（突變型/野生型）DNA模

板19-Del0/1780T790M0/1840L858R高濃度野生型基因組DNA中濃度野生型基因組DNA0/19000/79600/74000/7720低濃度野生型基因組DNA0/137800/138000/14420-L858R

/T790M陽性細胞系0/11720--DNA19-Dels

陽性細胞系DNA