轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物制藥

關(guān)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物制藥第1頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)其他動(dòng)物生物反應(yīng)器第2頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)經(jīng)歷了三個(gè)不同的歷史階段：天然藥物化學(xué)合成藥物基因工程藥物基因工程制藥也經(jīng)歷了三個(gè)階段：發(fā)酵工程細(xì)胞工程轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大腸桿菌酵母等微生物把人或哺乳動(dòng)物的基因直接導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制藥第3頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1980年，Gordon用DNA顯微注射法獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠1982年，Palmiter獲得“超級(jí)”小鼠1985年，轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬1986年，轉(zhuǎn)基因牛第4頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1987年，第一個(gè)動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器模型：Gorden等利用組織纖溶酶原激活劑（tPA）與小鼠乳清酸蛋白（WAP）啟動(dòng)子重組基因，在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中表達(dá)了tPA。第5頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器（mammaryglandbioreactor）是指利用動(dòng)物乳腺特異性啟動(dòng)子調(diào)控元件指導(dǎo)外源基因在乳腺中特異性表達(dá)，并能從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳汁中獲取重組蛋白的一種生物反應(yīng)器。第6頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1991年，英國(guó)愛(ài)丁堡制藥公司，轉(zhuǎn)基因綿羊：羊乳中含有1-抗胰蛋白酶（1-AT），含量高達(dá)16g/L，估計(jì)泌乳期的每只羊可產(chǎn)70g，價(jià)值達(dá)70萬(wàn)美元FDA已批準(zhǔn)應(yīng)用基因技術(shù)公司（AGTC）α1－AT進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)第7頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用1-AT缺乏癥：新生兒肝炎、肝硬化、肝癌、肺氣腫彈性蛋白酶破壞肝細(xì)胞細(xì)菌蛋白酶破壞肺組織α1-AT基因位于第14號(hào)染色體。α1-AT是肝臟產(chǎn)生的一種糖蛋白，廣泛分布于唾液、十二指腸液、呼吸道分泌物、淚液、鼻腔分泌物和腦脊液，是人體內(nèi)血清蛋白酶的主要抑制物。第8頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用目前，國(guó)際上已有30多家公司正在開(kāi)發(fā)乳腺生物反應(yīng)器。第9頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用2006年：世界上第一個(gè)利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（山羊）乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的基因工程藥物重組人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn

）上市

〔美國(guó)Genzyme公司旗下的GTCBiotherapeutics公司〕重組人抗凝血酶Ⅲ：可抑制血液中凝血酶活性，用于預(yù)防和治療血栓血塞形成，對(duì)治療抗凝血酶缺失癥具有顯著效果。全球每年的潛在市場(chǎng)約為1.5億美元。第10頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用其他應(yīng)用：利用轉(zhuǎn)基因綿羊、牛和兔乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的人α-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺氣腫）人組織纖維蛋白溶酶原激活劑（tPA,抗栓藥）人C1抑制劑（治療血管神經(jīng)性水腫）等這些重組蛋白藥物也已經(jīng)完成或進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)。另外還有10多種重組蛋白藥物處于臨床研究，上百種重組蛋白處于研發(fā)階段。

第11頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的應(yīng)用據(jù)美國(guó)權(quán)威機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，到2010年，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達(dá)到350億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個(gè)基因工程藥物種類的90%以上。第12頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)1、產(chǎn)量高，成本低蛋白血漿內(nèi)水平（g/L）重組蛋白水平（g/L）動(dòng)物種屬1-抗胰蛋白酶1.4~3.2小鼠10.0山羊7.0血紅蛋白——豬32.0長(zhǎng)效t-PA——山羊3.0抗凝血酶III0.17~0.39綿羊16.0小鼠10.0哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)：重組蛋白表達(dá)量為0.1～1g/L第13頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月乳腺組織是一種高效的產(chǎn)奶器官：奶牛：8000～10000L/頭·年，綿羊和山羊：800～1000L/頭·年1、產(chǎn)量高，成本低以最低表達(dá)量1g/L的重組蛋白計(jì)算：奶牛：8～10kg/頭·年綿羊和山羊：0.8～1kg/頭·年一頭奶牛重組蛋白年產(chǎn)量相當(dāng)于1000L發(fā)酵罐乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)第14頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月以防治A型血友病的凝血因子Ⅷ為例：美國(guó)目前的需求總量是120g血漿提?。盒?20萬(wàn)升血漿，1200萬(wàn)人次捐血轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：只需1.2頭轉(zhuǎn)基因牛

1、產(chǎn)量高，成本低乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)生產(chǎn)1g重組蛋白的成本：乳腺生物反應(yīng)器：0.02-0.50美元哺乳動(dòng)物細(xì)胞：

800-5000美元第15頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2、周期短一種新藥從研制開(kāi)發(fā)、通過(guò)藥審直到上市，約需10-15年的周期，用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物，周期可縮短5年。3、產(chǎn)品的質(zhì)量好，高活性生產(chǎn)的重組蛋白藥物生理活性好，與人同源性高，非常接近天然產(chǎn)品。乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)第16頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3、設(shè)備簡(jiǎn)單，不耗能，無(wú)污染該技術(shù)基本上為一畜牧業(yè)過(guò)程，雖飼養(yǎng)環(huán)境要求特別潔凈，但仍是給牛羊草料，由牛羊奶中提取藥品，因此蛋白生產(chǎn)過(guò)程不需昂貴設(shè)備，不消耗能源，不會(huì)產(chǎn)生工業(yè)廢料，也不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染，因此動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器制藥技術(shù)是一種可持續(xù)發(fā)展的新型生物制藥技術(shù)。

乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)PharmingFarming第17頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他動(dòng)物生物反應(yīng)器動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器動(dòng)物血液生物反應(yīng)器動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器

精液、蛋清、蠶繭動(dòng)物生物反應(yīng)器的主要類型第18頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月動(dòng)物血液生物反應(yīng)器血液中表達(dá)，大型家畜血液豐富，屠宰即可收獲產(chǎn)物產(chǎn)物進(jìn)入血液循環(huán)：有些物質(zhì)會(huì)影響動(dòng)物健康（如激素、細(xì)胞分裂素、血纖維溶酶因子等）外源蛋白與內(nèi)源蛋白難分離可生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體、生長(zhǎng)激素及非活性狀態(tài)的融合蛋白第19頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器報(bào)道較少，生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素取得初步成果優(yōu)點(diǎn)：1、從尿液中收集產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物無(wú)傷害2、分離純化經(jīng)濟(jì)有效，不需除脂肪等3、生產(chǎn)周期短，不管是雌、雄動(dòng)物從出生開(kāi)始就可獲得表達(dá)產(chǎn)物第20頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月精液系統(tǒng)有些動(dòng)物精液很豐富并易于收集，如豬第21頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月精液系統(tǒng)研究例子：小鼠的P12基因啟動(dòng)區(qū)可特異地驅(qū)動(dòng)在雄性小鼠的附性腺表達(dá)，已用來(lái)表達(dá)人生長(zhǎng)激素。該激素在轉(zhuǎn)基因小鼠精液中高達(dá)0.5mg/ml精液系統(tǒng)與尿液一樣，具有特異性的優(yōu)點(diǎn)，但復(fù)雜的蛋白質(zhì)在此兩種系統(tǒng)中成熟與分泌的情況如何，目前尚不太清楚第22頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蛋清系統(tǒng)蛋清含量豐富，所含蛋白質(zhì)的量高，且分泌到體外，有望成為重組蛋白質(zhì)的優(yōu)良生產(chǎn)系統(tǒng)最近已得到在蛋清中生成外源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因雞，但在總體上，禽類的轉(zhuǎn)基因技術(shù)還不成熟第23頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月蠶繭系統(tǒng)蠶繭含有大量的蠶絲蛋白質(zhì)，也具有乳汁和蛋清所具有的某些性質(zhì)往卵中注射線性質(zhì)粒，或利用多角體病毒載體都可以成功地實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因蠶易于大量繁殖，也有望開(kāi)發(fā)成生物反應(yīng)器外源蛋白的成熟有待評(píng)估第24頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S2轉(zhuǎn)基因植物制藥植物細(xì)胞工程是指定向改造植物細(xì)胞遺傳性，利用植物細(xì)胞生產(chǎn)有用物質(zhì)的技術(shù)。目前應(yīng)用最廣的有三方面內(nèi)容：1、植物的無(wú)性快速繁殖及育種2、細(xì)胞大量培養(yǎng)及生產(chǎn)藥用成分（次生代謝物生產(chǎn)）3、轉(zhuǎn)基因植物：疫苗、抗體等第25頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物基因工程疫苗第26頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物基因工程疫苗第27頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物基因工程抗體第28頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物基因工程抗體第29頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物基因工程抗體第30頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他重組蛋白藥物第31頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其他重組蛋白藥物第32頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月S2轉(zhuǎn)基因植物制藥植物基因工程疫苗的可行性研究植物基因工程疫苗的基本原理植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方式植物基因工程疫苗的優(yōu)勢(shì)存在問(wèn)題及今后研究重點(diǎn)第33頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月可行性研究1、Curtiss&Cardineau（1990）發(fā)表了第一篇關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物疫苗的文獻(xiàn)2、Mason（1992）等報(bào)道了乙肝表面抗原在植物中的表達(dá)，提出了利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)疫苗的概念3、Arntzen（1992）：在植物中表達(dá)的乙肝抗原能保持蛋白質(zhì)折疊的特性，保留了激發(fā)Ｂ細(xì)胞和Ｔ細(xì)胞免疫反應(yīng)的抗原決定簇4、Modelska（1998）&Brennan（1999）：植物基因工程疫苗以粘膜組織給藥的方式可引起粘膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答第34頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月基本原理1、將病毒或病原體的抗原基因在植物中進(jìn)行高效表達(dá)2、抗原蛋白仍保留自然狀態(tài)的免疫原性，當(dāng)將它產(chǎn)生的抗原作為食物時(shí)，可刺激體液和粘膜免疫應(yīng)答，可安全通過(guò)動(dòng)物消化道而不會(huì)被蛋白酶降解，成為粘膜性抗原只需口服少量表面抗原蛋白就可產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)第35頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇要根據(jù)不同的需要和轉(zhuǎn)化的難易程度，選擇不同的表達(dá)系統(tǒng)1、煙草：作為模式植物易操作，易種植并大量供應(yīng)，葉組織在5-6ｗ內(nèi)即可用于分析；但是葉組織中含有有毒物質(zhì)，不能用于飼喂研究2、馬鈴薯：容易轉(zhuǎn)化，有些塊莖特異性表達(dá)啟動(dòng)子，8-10ｗ內(nèi)即可用于分析；但它蛋白含量低第36頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇3、豆類或谷類作物：種植廣泛、產(chǎn)量高、種子中重組蛋白表達(dá)含量較高，種子易于儲(chǔ)存，適合于飼喂動(dòng)物用于免疫，用于動(dòng)物疫苗較為理想4、番茄、黃瓜等蔬菜類：可生食，生產(chǎn)人類疫苗5、香蕉：老少皆宜，用于人類疫苗理想的植物，但轉(zhuǎn)化效率不高，需大量口服才能達(dá)到較好免疫效果6、玉米：主要的飼料原料，不需經(jīng)提取，使用方便，在飼喂動(dòng)物的同時(shí)就可預(yù)防疾病的發(fā)生，成本低于其他疫苗第37頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)方式穩(wěn)定表達(dá)

——外源抗原基因直接轉(zhuǎn)染植物基因組瞬時(shí)表達(dá)

——植物病毒載體瞬時(shí)表達(dá)外源抗原基因第38頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月穩(wěn)定表達(dá)啟動(dòng)子：主要采用CaMV35S組成型表達(dá)啟動(dòng)子，但其表達(dá)水平較低應(yīng)用：乙肝表面抗原（HBsAg）、鏈球菌變異株spaＡ蛋白、大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素Ｂ亞單位和霍亂毒素Ｂ亞單位等優(yōu)點(diǎn)：可通過(guò)雜交生產(chǎn)多價(jià)疫苗第39頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瞬時(shí)表達(dá)利用植物病毒作為載體，將目的基因插入到病毒基因組中，然后將重組病毒接種到植物葉片上，這樣，隨著病毒的復(fù)制，外源基因被高效的表達(dá)出來(lái)。1、將抗原基因置于病毒基因組啟動(dòng)子控制之下2、將抗原基因與病毒外殼蛋白融合在一起第40頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瞬時(shí)表達(dá)載體：椰菜花葉病毒（CaMV）、煙草花葉病毒（TMV）和豇豆花葉病毒（CMPV）馬鈴薯X病毒（PVX）特點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)量比較高，在接種后1-2ｗ內(nèi)外源基因就可達(dá)到最大量的積累。第41頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瞬時(shí)表達(dá)植物病毒作為瞬時(shí)表達(dá)的載體的優(yōu)點(diǎn)：1、病毒增殖速度快，外源基因在較短的時(shí)間內(nèi)，通常在接種后1-2周以內(nèi)就可達(dá)到最大量的積累2、病毒增殖水平較高，可使伴隨的外源基因有高水平表達(dá)第42頁(yè)，課件共48頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月瞬時(shí)表達(dá)植物病毒作為瞬時(shí)表達(dá)的載體的優(yōu)點(diǎn)：3、植物病毒的基因組很小，易于進(jìn)行遺傳操作，而大多數(shù)植物病毒可以通過(guò)機(jī)械接種感染植物，這樣適于大規(guī)模的商業(yè)操作4、植物病毒可以侵染單子葉等非農(nóng)桿菌的寄主植物，擴(kuò)大了轉(zhuǎn)