微核檢測技術(shù)郭

植物微核檢測技術(shù)哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳教研室2010年3月背景知識——毒理遺傳學(xué)：或稱遺傳毒理學(xué)，用遺傳學(xué)方法研究環(huán)境因素對遺傳物質(zhì)的損害及其毒理效應(yīng)的遺傳學(xué)分支學(xué)科，提供了許多迅速、準(zhǔn)確、簡便的方法來檢測各種環(huán)境因素對遺傳結(jié)構(gòu)的危害，以便采取措施，減少這些因素對人類的危害。應(yīng)用：評價各種化學(xué)物的安全性（藥物的臨床過渡），人類環(huán)境的現(xiàn)場監(jiān)測、人群健康監(jiān)測（職業(yè)病的防治）以及遺傳毒性與疾病、腫瘤的流行病學(xué)調(diào)查等。環(huán)境中可產(chǎn)生誘變的因素：物理誘變：如紫外線，X-射線，γ-射線，快中子，激光，微波，離子束等。化學(xué)誘變：如烷化劑(包括EMS、EI、NEU、NMU、DES、MNNG、NTG等)，天然堿基類似物,氯化鋰、亞硝基化合物、疊氮化物、堿基類似物、抗生素、羥胺和吖啶等嵌入染料。空間誘變：宇宙系列生物衛(wèi)星、科學(xué)返回衛(wèi)星、空間站及航天飛機(jī)等空間飛行器進(jìn)行搭載。復(fù)合誘變：兩種或多種誘變劑的先后使用。環(huán)境因素造成的遺傳毒理效應(yīng)：

“三致效應(yīng)”突變形成：環(huán)境因素誘發(fā)生殖細(xì)胞的基因突變（點突變）和染色體畸變，從而造成子代遺傳性疾病發(fā)生頻率的增加，癌形成：環(huán)境因素誘發(fā)體細(xì)胞基因突變或在親代遺傳的突變形成的背景上誘發(fā)體細(xì)胞突變，引起的體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的作用；致畸效應(yīng)：環(huán)境因素作用于發(fā)育中的胚胎細(xì)胞干擾了基因的正常作用，從而影響到胚胎細(xì)胞分化和器官系統(tǒng)的發(fā)育而導(dǎo)致畸胎的發(fā)生，也包括環(huán)境因素誘發(fā)親代生殖細(xì)胞的基因突變或染色體畸變引起畸胎的作用。腫瘤的發(fā)生和類型“三致效應(yīng)”的檢測方法：早期的方法：用待測化學(xué)物質(zhì)喂飼、注射動物或涂布在動物皮膚上，然后觀查動物是否因此而患腫瘤或出現(xiàn)畸胎等，可檢測各種化學(xué)物質(zhì)的致癌和在胚胎發(fā)育過程中的致畸效應(yīng)?，F(xiàn)在一般都采用細(xì)菌、離體培養(yǎng)的哺乳動物和人類體細(xì)胞、植物為測試對象，主要的方法有：①以基因突變?yōu)橹笜?biāo)的檢測法②以染色體為指標(biāo)的方法以染色體為指標(biāo)的“三致

效應(yīng)”的檢測方法：

經(jīng)典的染色體畸變分析方法；姐妹染色單體互換測試法；微核測試法。（1）斷片（2）雙著絲點（3）環(huán)微核遺傳毒理評價所用的材料：利用植物、昆蟲（果蠅）、水生動物等生物的細(xì)胞可以現(xiàn)場監(jiān)測水源、空氣及作業(yè)環(huán)境中遺傳毒物的存在。為此，發(fā)展了紫露草花序、蠶豆根尖、魚紅細(xì)胞遺傳毒性試驗方法以及Ames（原生動物）空氣現(xiàn)場采樣方法等。動物細(xì)胞：小鼠骨髓細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等。應(yīng)用多種人類細(xì)胞：口腔粘膜細(xì)胞、鼻腔粘膜細(xì)胞、頭皮毛囊細(xì)胞、痰液細(xì)胞等檢測微核、染色體畸變、姐妹染色單體互換率等指標(biāo)，對人類接觸遺傳毒物的劑量及效應(yīng)進(jìn)行評價。微核測試法：

（micronucleustest,MNT）20世紀(jì)70年代初期由Matter和Schmid首先建立了一種簡便、快速、評價客觀地檢測來自環(huán)境中的各種理化及生物因子對機(jī)體產(chǎn)生潛在的遺傳損傷方法，即用哺乳動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核（polychromaticerythrocyte,PCE）出現(xiàn)率的實驗方法。由于大量新的化合物的合成、原子能的應(yīng)用、各種工業(yè)廢物的排出，需要有一套高度靈敏、技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核生物的測試結(jié)果更能直接推測反映誘變物質(zhì)對人類或其他高等生物的遺傳危害，微核測試是一種比較理想的方法。目前國內(nèi)外已把微核測試用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、食品添加劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。智能全自動微核分析系統(tǒng)：法國IMSTAR本實驗的目的：通過植物根尖微核試驗，學(xué)習(xí)微核的制片技術(shù)、識別及計數(shù)方法。掌握評價理化因子對機(jī)體遺傳損傷的快速篩選方法。實驗原理：微核（micronucleus,MN）是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)。由于細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物等作用使染色體受到損傷，在有絲分裂中、后期細(xì)胞中形成喪失著絲粒的染色體單體或染色體斷片，游離于子細(xì)胞質(zhì)中形成的次核。在間期細(xì)胞中，常常見到比普通細(xì)胞核小很多的一個或幾個圓形結(jié)構(gòu)，其直徑大約相當(dāng)于細(xì)胞直徑的1/20~1/3。微核率與用藥劑量或輻射積累效應(yīng)呈正相關(guān)。實驗材料：毛蔥（Alliumfistulosum）根尖。實驗器材：顯微鏡，冰箱，水浴鍋，分析天平，剪刀，鑷子，刀片，載玻片，蓋玻片，濾紙，量筒，滴瓶，酒精燈，指管等。試劑環(huán)磷酰胺（CP）卡諾氏（Carnoy‘s）固定液希夫（Schiff‘s）試劑45%醋酸

1N鹽酸實驗賓步驟純：根尖輪的培唇養(yǎng)環(huán)磷鞏酰胺坊處理固定解離染色壓片鏡檢蔑及觀牲察實驗頌材料塑準(zhǔn)備臨時志裝片妄制片細(xì)胞學(xué)鑒定誘變處理實驗茄材料渴準(zhǔn)備——誘變怖處理毛蔥洲沙培渣生根淹，室休溫下2-姓3天即除長出0.榴5需~脅1c聲m長的性根；置于環(huán)磷犬酰胺垃溶液雨中處理24小時塊；從藥牲液中摩取出棵，水爭洗后礙清水便培養(yǎng)24小時辦；水洗擠后用Ca滿rn懸oy綱’s固定俊液固欲定24小時核，水藍(lán)洗，栽轉(zhuǎn)入70羊%乙醇匆中保黃存。臨時謊裝片府制片——細(xì)胞箏學(xué)鑒焦定解離：取70菊%乙醇栗中保建存的狠根尖悔水洗猾兩次剩，用1NHC亮l在60摧℃處理類根尖8-訂10謙mi擇n后，像水洗3~斥4次，桶每次5m撐in。染色：根奮尖在尸有蓋拼的小跟瓶中拖加入雀希夫麥（Sc掛hi益ff）試劑脈染色30翻mi方n~毫2h。壓片：在須干凈找的載惜玻片喪上切離下根柳尖分陵生區(qū)館，滴襯一滴45足%醋酸禁，加貿(mào)蓋玻姐片，差用濾擦紙吸陸凈多廢余的危液體術(shù)，一籠手壓土住蓋艦玻片夸一角幫，另調(diào)一手笛持竹釣針輕衣敲蓋毛玻片身至組都織呈款云霧禁狀。攜將載育玻片押在酒尤精燈律上輕育烤，蘿在蓋虛玻片儉上覆災(zāi)濾紙汽條，惡用拇由指垂姿直按紹壓制爐片。鏡檢矛及觀象察。結(jié)果澇及分蛛析：細(xì)胞狂學(xué)觀催察：在細(xì)姨胞分震裂間砍期，暢微核未呈圓肢形或端橢圓豈形，柄游離拌于主粱核之曲外，鈴大小勤在主授核的1/賞3以下筒，折耕光率殲及細(xì)左胞化狠學(xué)反獨應(yīng)性臨質(zhì)和磚主核芽一樣爽。蠶豆割根尖下微核咬照片2.微核什率計愉算微核的率（MC刻N%o）=微核敗數(shù)/細(xì)胞信數(shù)×10市00索%o微核勢檢測悠記錄文表片號細(xì)胞數(shù)微核數(shù)微核千分率第一片第二片第三片總計作業(yè)咳和思軍考題買：敘述伯微核疊形成驕原理僑。統(tǒng)計煎微核巷細(xì)胞驅(qū)數(shù)，敗計算旋微核侵細(xì)胞肌千分鍋率。畫出讓具有斧微核墨的細(xì)辯胞示犧意圖艷。注意戲事項碼：處在狼分裂扣過程壞中的