懷地黃和懷山藥多糖同步提取工藝研究

懷地黃和懷山藥多糖同步提取工藝研究【摘要】目的對(duì)懷地黃［Rehmanniaglutinosa(ChanetSchih)Hsiao，簡(jiǎn)稱(chēng)RG］多糖和懷山藥(DioscoreaoppositeThumbHsiao，簡(jiǎn)稱(chēng)DT)多糖同步提取方法的工藝參數(shù)進(jìn)行了研究。方法選取提取溫度、提取液pH、固液比3個(gè)因素，以多糖含量作為指標(biāo)，通過(guò)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳工藝參數(shù)。結(jié)果懷山藥與懷地黃多糖同步提取的最佳工藝參數(shù)為：浸提溫度65℃，浸提液pH，固液比為1∶30；浸提液濃縮比為4∶1，沉降劑乙醇添加量5倍于浸提液體積；采用Sevage法去除蛋白質(zhì)，提取得到的懷山藥與懷地黃同步多糖含量及得率可分別為%和%。結(jié)論用同步提取法得到的多糖含量及得率優(yōu)于分步提取。

【關(guān)鍵詞】懷地黃多糖懷山藥多糖同步提取混合多糖

懷山藥，又名山芋、菜山藥，為薯蕷科多年生纏繞型草本植物，以根莖入藥［1］。山藥多糖是山藥中的主要活性成分。懷地黃具有止血和促進(jìn)血細(xì)胞增殖的藥理活性，同時(shí)可以通過(guò)影響白血球和血小板來(lái)抗炎［2］。懷地黃在中醫(yī)藥中被認(rèn)為是治療糖尿病的“四大圣藥”之一，現(xiàn)代藥理研究也證明其具有降血糖的作用［3］。研究表明懷山藥多糖與懷地黃多糖同步后對(duì)四氧嘧啶導(dǎo)致糖尿病的小鼠具有較好的治療效果［4］。由于目前天然產(chǎn)物提取往往采用分步提取而忽略大多天然產(chǎn)物多糖需要進(jìn)行復(fù)配才能起到有效的效果，因此對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行同步提取可以簡(jiǎn)化提取步驟，提高多糖含量。

1材料與儀器

懷地黃；懷山藥；乙醇、正丁醇、三氯甲烷、葡萄糖、苯酚試劑均為分析純,濃硫酸為優(yōu)級(jí)純；SP-2000UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，薄膜蒸發(fā)儀。

2方法

懷山藥與懷地黃多糖同步提取及懷山藥工藝流程

懷山藥與懷地黃多糖同步提取工藝取一定量懷地黃、懷山藥，粉碎至100目，加入30倍水，浸提4h，離心收集得到第1次浸提液。向藥渣中加入20倍水、90℃下、浸提2h后離心收集得到第2次浸提液，合并兩次收集的浸提液，減壓濃縮。Sevage法除蛋白，重復(fù)兩次，乙醇沉淀后，離心回收沉淀，真空干燥得懷山藥與懷地黃同步多糖粗品。

懷山藥多糖分步提取工藝［5］取一定量懷山藥，粉碎至100目，加入20倍水，纖維素酶加量%，65℃浸提4h，離心收集得到第1次浸提液。向藥渣中加入25倍水、90℃下、浸提2h后離心收集得到第2次浸提液，合并兩次收集的浸提液，減壓濃縮。Sevage法除蛋白，重復(fù)兩次，乙醇沉淀后，離心回收沉淀，真空干燥得懷山藥多糖粗品。

懷地黃多糖分步提取工藝［6］取一定量懷地黃，粉碎至100目，加入20倍水，纖維素酶加量%，65℃浸提4h，離心收集得到第1次浸提液。向藥渣中加入25倍水、90℃下、浸提2h后離心收集得到第2次浸提液，合并兩次收集的浸提液，減壓濃縮。Sevage法除蛋白，重復(fù)兩次，乙醇沉淀后，離心回收沉淀，真空干燥得懷地黃多糖粗品。

同步多糖蛋白質(zhì)脫除方法［7］

三氯乙酸法［8］收集100ml懷地黃與懷山藥浸提液，加入100ml30％的三氯乙酸溶液，靜置，離心，上清液減壓濃縮至原液體積1/4，加入5倍于濃縮液體積的95％乙醇，靜置，離心，收集沉淀物，分析懷山藥與懷地黃多糖含量及得率。

Sevag法［9］收集100ml懷地黃與懷山藥浸提液，加入20ml的Sevag試劑，劇烈振蕩30min，離心，回收上層清液，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行第2次蛋白的去除，離心后取上層清液減壓濃縮至原液體積1/4，加入5倍于濃縮液體積的95％乙醇，靜置，離心，收集沉淀物，分析懷山藥與懷地黃多糖含量及得率。

浸提液濃縮倍數(shù)與乙醇添加量對(duì)同步多糖提取得率的影響稱(chēng)取懷地黃40g，熱水浸提后，3000r/min離心30min，收集浸提液3200ml，各取200ml采用不同的濃縮倍數(shù)和沉降劑添加量進(jìn)行沉降，3500r/min離心，收集沉淀物，分析同步多糖得率。

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選懷山藥與懷地黃多糖提取工藝懷山藥、懷地黃多糖同步提取中，為了獲得最大多糖含量，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，選擇提取溫度、提取液pH值和固液比3個(gè)主要工藝參數(shù)作為考察因素，每因素選取3個(gè)水平，按L9(33)正交表安排實(shí)驗(yàn)，以同步多糖含量作為衡量提取效率的指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝參數(shù)。為了提高其統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，每一條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果取其平均值供統(tǒng)計(jì)分析用。

多糖含量與得率的測(cè)定方法苯酚-硫酸法［2］。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確稱(chēng)取干燥的無(wú)水葡萄糖(105℃干燥至恒重)標(biāo)準(zhǔn)品mg，于500ml容量瓶中加蒸餾水定容。分別精確吸取，，，，，，，，ml標(biāo)準(zhǔn)液于比色管中，各加蒸餾水至ml，以蒸餾水為空白對(duì)照做3組平行實(shí)驗(yàn)，再分別加入6%苯酚溶液ml、濃硫酸5ml，迅速振蕩均勻，室溫顯色40min。另取1ml蒸餾水，加入等量苯酚溶液和濃硫酸，作為空白對(duì)照，將上述試樣置于SP-2000UV型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中，于最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸收度,以吸收度為縱坐標(biāo)，對(duì)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。見(jiàn)圖1。

如圖1所示，經(jīng)回歸分析，得到回歸方程Y=，在葡萄糖濃度～mg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，R2=。

供試液懷地黃與懷山藥同步多糖含量測(cè)定取適量的多糖供試液，分別加入6%苯酚溶液ml，濃硫酸5ml，迅速振蕩均勻,室溫顯色40min，測(cè)定各供試液吸收值，利用回歸方程求得供試液中葡萄糖的含量。按下式計(jì)算樣品中多糖含量

多糖含量=C×DW

C為樣品液中葡萄糖的濃度；D為供試液的稀釋因素；W為供試樣品重量。

懷山藥與懷地黃同步多糖得率的測(cè)定：

多糖得率=所得粗品多糖重量×多糖含量原料重量×100%

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3結(jié)果

同步多糖蛋白質(zhì)脫除方法的優(yōu)選蛋白質(zhì)具有和多糖相似的溶解性，采用水提醇沉等方法所得的多糖中常存在一定量的蛋白質(zhì)。常用的脫蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸法、酶法脫蛋白等。圖2是Sevage法、TCA法同步多糖提取過(guò)程中同步多糖含量及得率的影響結(jié)果。由圖2可知，經(jīng)Sevage法脫蛋白處理后同步多糖的含量和得率可分別達(dá)到％和％；明顯高于TCA法，從而選擇Sevage法除蛋白。

圖2不同蛋白質(zhì)去除法對(duì)同步多糖的影響

浸提液濃縮倍數(shù)與乙醇添加量對(duì)多糖提取的影響乙醇是常用的多糖沉降劑。浸提液濃縮倍數(shù)和乙醇添加量是影響多糖沉降的關(guān)鍵因素，對(duì)RGP的得率有較大的影響，結(jié)果。由表1可知，浸提液濃縮比為4∶1時(shí)，同步多糖得率達(dá)到最高，為％，這說(shuō)明濃縮后浸提液過(guò)稀和過(guò)稠都不利于多糖沉降。此外，同步多糖得率達(dá)到最高時(shí)乙醇添加量為濃縮液的5倍量，說(shuō)明盡管沉降劑乙醇可降低多糖溶解度促進(jìn)沉降，但過(guò)高的乙醇添加量又會(huì)增加溶液總體積而對(duì)沉降產(chǎn)生不利影響。

表1濃縮比及乙醇加量對(duì)多糖得率的影響

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選懷山藥多糖與懷地黃多糖同步提取工藝條件表2～4的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明因素C對(duì)懷地黃與懷山藥同步多糖的提取有顯著影響，而因素A、B對(duì)提取無(wú)顯著影響。由極差R得出影響因素大小順序?yàn)椋篊BA。最佳提取工藝參數(shù)為A1B3C2，即在DEET法提取懷地黃多糖時(shí)的最佳工藝參數(shù)是：pH值，加酶量%，溫度65℃，固液比為1∶30。依據(jù)上述最佳工藝A1B3C2進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,懷地黃多糖平均含量為%。

表2因素水平

表3L9(34)正交實(shí)驗(yàn)分析

同步提取多糖與分步提取多糖的比較同步提取時(shí)，選用懷山藥與懷地黃各10g進(jìn)行水提法提?。环植教崛t各取懷山藥、懷地黃10g分別采用雙酶法進(jìn)行提取，計(jì)算提取后多糖得率與多糖含量，并對(duì)分步提取后的多糖進(jìn)行混合復(fù)配，計(jì)算其多糖含量，并與同步提取法所得多糖含量進(jìn)行對(duì)比，分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表4方差分析

*表示具有明顯效果項(xiàng)

表5多糖同步提取與單一水提法提取多糖含量對(duì)比

分步提取采用雙酶法；同步提取采用水提法

懷山藥與懷地黃同步提取所得多糖含量與得率相比酶法分步提取懷地黃、懷山藥多糖，其多糖得率與含量略有提高。

4討論

傳統(tǒng)的從天然產(chǎn)物中提取多糖是對(duì)單一產(chǎn)品進(jìn)行提取，而本實(shí)驗(yàn)中是對(duì)懷山藥和懷地黃單獨(dú)進(jìn)行提取的基礎(chǔ)上，將兩種材料同步后進(jìn)行提取，開(kāi)創(chuàng)了多糖提取的新思路。

同樣量的懷山藥和懷地黃同步提取相比兩種材料單獨(dú)提取，得到的多糖得率和多糖含量均有很大的提高。由于后續(xù)的繼續(xù)純化成本較高，該方法不僅提高了中藥材的利用率，為后續(xù)純化降低了成本。

作為目前中藥研究中，只針對(duì)單一中藥成分進(jìn)行研究，而往往忽略中藥處方藥為多種中藥同步。本實(shí)驗(yàn)為將來(lái)進(jìn)行處方藥有效成分的提取進(jìn)行初步的研究。

本論文采用雙酶法進(jìn)行分步提取進(jìn)行對(duì)照，而雙酶法提取是目前研究單一天然產(chǎn)物提取中得到多糖含量較高的一種方法，常規(guī)提取方式為水提法［8］。目前本實(shí)驗(yàn)室所得水提法的懷地黃多糖與懷山藥多糖的多糖含量分別為：%和%［10］。遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于同步提取所得多糖含量。

同步提取可以簡(jiǎn)化天然產(chǎn)物提取工藝，并且其提取后所得多糖含量要略高于雙酶法分步提取天然產(chǎn)物多糖含量之和，節(jié)省了酶制劑的用量，降低了生產(chǎn)難度，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，從而降低了天然產(chǎn)物有效成分生產(chǎn)成本。

研究發(fā)現(xiàn)懷山藥與懷地黃多糖同步提取后，顏色較懷地黃多糖提取后較淺，并形成了外層為褐色中間為白色的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。推測(cè)可能是多糖提取過(guò)程中，色素脫離并再次沉降附著在所提取多糖表面上。

本實(shí)驗(yàn)所得同步多糖的樣品與多糖單一提取后所得多糖的粘性要遠(yuǎn)小于懷地黃多糖的粘度，造成這種差異的原因有待進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

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