動物胚胎移植技術(shù)及體外受精

動物胚胎移植技術(shù)及體外受精第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五現(xiàn)代生物技術(shù)家畜育種領(lǐng)域繁殖生物技術(shù)分子生物技術(shù)人工授精技術(shù)胚胎工程技術(shù)

超數(shù)排卵和胚胎移植胚胎性別鑒定體外受精胚胎分割克隆技術(shù)第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五試管嬰兒體外受精聯(lián)合胚胎移植技術(shù)（IVF）1978年英國專家steptoe和Edowrds定制了世界上第一個試管嬰兒1978年7月25日世界第一例試管嬰兒LouisBrown在英國誕生。IVF的最早階段妊娠成功率只有2.94％。大陸首例試管嬰兒鄭萌珠于1988年3月10日上午8點(diǎn)56分在北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院誕生第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)胚胎工程技術(shù)胚胎移植胚胎融合胚胎分割胚胎的冷凍保存早期胚胎培養(yǎng)胚細(xì)胞核移植第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五受精過程①分解放射冠的卵泡細(xì)胞②水解局部透明帶③精子細(xì)胞核和部分胞質(zhì)進(jìn)入卵母細(xì)胞第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五卵裂及胚泡形成（第一周）卵裂(cleavage)受精卵由輸卵管向子宮方向運(yùn)行，并不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，受精卵早期的細(xì)胞分裂稱卵裂；卵裂產(chǎn)生的子細(xì)胞呈球形，稱卵裂球（blastomere）桑椹胚（morula）受精后第3天，形成了12~16個卵裂球組成的實心胚，形似桑椹，稱桑椹胚第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五胚泡形成

受精后第4~6天桑椹胚細(xì)胞繼續(xù)分裂，細(xì)胞間開始出現(xiàn)小腔隙，并逐漸匯合成一個大腔，桑椹胚轉(zhuǎn)變?yōu)橹锌盏呐轄?，稱胚泡（blastocyst），胚泡由三部分組成：

胚泡滋養(yǎng)層胚泡腔內(nèi)細(xì)胞群極端滋養(yǎng)層第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五一、胚胎移植受精卵移植把一頭雌性動物的早期胚胎從輸卵管或子宮中沖洗出來，移植到另一頭雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)，使之繼續(xù)發(fā)育成新個體的技術(shù)供體提供胚胎的動物受體接受和孕育胚胎的動物第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五初始階段1890-1900W.Heape將安哥拉兔和荷蘭兔的受精卵分別移植到比利時兔的輸卵管內(nèi)，分別獲得仔兔2只1900-1950主要由英美科學(xué)家在家兔、綿羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右發(fā)展階段1950-1970日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手術(shù)法移植成功，胚胎移植成功率達(dá)70-80%胚胎移植的歷史第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五實用化初始階段

1970-1980加美開始成立牛胚胎移植公司，1973年牛凍胚移植成功（英）實用化研究階段

1982-大規(guī)模胚胎移植、核移植、嵌合體、胚胎分割、性別鑒定、體外受精在英美日德廣泛開展，克隆羊誕生胚胎移植的歷史第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)成年母畜卵巢上存在數(shù)千到上萬個卵泡，在外源激素作用下，每個發(fā)情期的卵泡發(fā)育和排卵數(shù)可達(dá)數(shù)十個每個發(fā)情周期生殖器官都有一個孕向發(fā)育早期胚胎處于游離狀態(tài)胚胎發(fā)育不存在免疫問題胚胎發(fā)育到一定階段會與子宮發(fā)生生理和組織聯(lián)系胚胎的遺傳性不受受體的影響第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2.胚胎移植的基本原則胚胎移植前后所處的環(huán)境的同一性供體和受體在分類學(xué)上的相同屬性動物生理上的一致性：受體和供體在發(fā)情時間上的同期性動物解剖位置上的一致性：空間環(huán)境的一致性胚胎的發(fā)育期限：必須處于周期黃體期內(nèi)胚胎的質(zhì)量：胚胎必須是正常的，并在處理過程中不受不良因素的影響第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3、胚胎移植供受體的選擇與管理供體的超數(shù)排卵處理和配種受體的同期發(fā)情處理胚胎回收胚胎檢查胚胎移植第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1）供受體的選擇與管理供體的選擇遺傳價值：生產(chǎn)性能優(yōu)秀的母畜健康狀況:身體健康，營養(yǎng)水平中等以上的未孕動物繁殖性能：達(dá)到配種年齡以上繁殖機(jī)能正常的母畜第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五受體的選擇身體健康，身體狀況中上的適繁未孕個體，無生殖道疾病和難產(chǎn)病史繁殖狀況正常，有正常的發(fā)情周期母性良好：泌乳性能、護(hù)仔性能供、受體的管理防疫、記錄飼養(yǎng)管理等第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

2）同期發(fā)情（synchronizationofeatrus）采用激素或類激素的藥物處理，使這一群母畜在特定時間內(nèi)集中發(fā)情和排卵即將母畜的黃體期延長或縮短，使母畜擺脫內(nèi)、外孕激素對卵巢的控制，在同一時間內(nèi)引起全部母畜的卵泡發(fā)育，從而達(dá)到同期發(fā)情的目的第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五延長黃體期：孕激素控制卵泡的生長發(fā)育和發(fā)情表現(xiàn)縮短黃體期：前列腺素加速黃體退化，使卵巢提前擺脫體內(nèi)孕激素的控制促進(jìn)卵泡發(fā)育、排卵：促性腺激素

第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3）超數(shù)排卵超排：以各種外源性促性腺激素誘發(fā)動物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受精能力的卵子孕母馬促性腺激素、促卵泡素、前列腺素、促排卵類藥物、孕激素超數(shù)排卵處理的時期應(yīng)選擇在發(fā)情周期的后期，即黃體消退時期第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五個體對超排處理的反應(yīng)效果難以預(yù)測產(chǎn)生不良的后果：胚胎死亡卵母細(xì)胞蛋白質(zhì)合成過程發(fā)生改變生殖道機(jī)能產(chǎn)生影響第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五4）胚胎回收利用沖胚液從供體的生殖道中沖洗出來，提供移植或其它胚胎工程用手術(shù)法非手術(shù)法第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五胚胎質(zhì)量評價：透明帶的形態(tài)和完整性胚胎的發(fā)育與胚齡是否一致胚胎的形態(tài)與勻稱性，胚內(nèi)細(xì)胞大小的變化細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)及顏色，胚內(nèi)是否出現(xiàn)空泡，細(xì)胞碎片，有無游離細(xì)胞如A級：

為優(yōu)良胚胎，形態(tài)典型，卵裂球輪廓清晰，緊密充實，大小均一，細(xì)胞質(zhì)致密，色調(diào)和分布均一第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五6）胚胎的保存胚胎的降溫：使胚胎停止發(fā)育，延長其體外生存時間體外培養(yǎng)：將胚胎置于體溫條件下，在培養(yǎng)液中，使其繼續(xù)發(fā)育胚胎冷凍：通過一定的處理程序，將胚胎降溫冷凍后，保存于液氮中第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五胚胎冷凍的原理胚胎冷凍實際是脫水的過程，冷凍保存的關(guān)鍵是設(shè)法減少細(xì)胞內(nèi)冰晶對胚胎的損傷冷凍過程中，水分形成冰晶造成細(xì)胞機(jī)械損傷，同時，導(dǎo)致未結(jié)冰的細(xì)胞內(nèi)溶液滲透壓急劇升高，造成蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致死胎常規(guī)慢速冷凍法、玻璃化冷凍保持第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五受精卵移植一般供體為良種或優(yōu)良個體，而受體為生產(chǎn)性能較差的個體或品種。“借劣質(zhì)動物之腹懷優(yōu)秀個體之胎”7）胚胎移植第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五選擇供體母牛受體母?！诎l(fā)情處理……超數(shù)排卵供體公牛配種沖卵質(zhì)量檢查、培養(yǎng)胚胎移植妊娠檢查分娩（胚胎移植的犢牛）胚胎移植的基本程序第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

8)胚胎移植的應(yīng)用范圍在家畜改良方面的應(yīng)用在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用在動物生物多樣性上的應(yīng)用其它方面應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因動物、性別控制、體外受精第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五在家畜改良方面的應(yīng)用人工授精技術(shù)可成幾十到幾百倍地提高了優(yōu)秀種公畜的配種效能，但對優(yōu)秀母畜來說，受其產(chǎn)仔數(shù)和世代間隔的限制，尤其是牛羊等繁殖力較低的畜種更是如此通過超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（multipleovulationandembryotransfer:MOET)牛羊的生長性狀年遺傳進(jìn)展可比正常繁殖提高80%和70%；產(chǎn)奶性狀提高33%第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五在特定品種擴(kuò)繁上的應(yīng)用牛羊等低繁殖力家畜，從引進(jìn)到形成一個純種群體需要7-8個世代，15-20年，而采用MEOT法，一次就可獲得一個純種群體80年代初，美、澳、新從歐洲引進(jìn)的大型肉牛品種均采用胚胎移植技術(shù)擴(kuò)繁2000年前后，我國的波爾山羊也是采用胚胎移植進(jìn)行擴(kuò)繁的第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五在動物生物多樣性上的應(yīng)用在保護(hù)動物遺傳資源，提高家畜生產(chǎn)性能，挽救瀕臨滅絕的野生動物方面，胚胎移植技術(shù)越來越發(fā)揮出重要作用冷凍能夠很好地保存瀕臨滅絕動物的胚胎或生殖細(xì)胞，但該種動物雌性個體的減少，也是這種動物的胚胎或生殖細(xì)胞無法得到移植，科學(xué)家開始研究在該種動物的亞種或親緣種中試驗，并取得一些成功，如斑馬胚胎移植給馬，蒙古馬胚胎移植給驢，白肢野牛移植給荷斯坦牛第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五其它方面應(yīng)用胚胎移植是克隆技術(shù)的必須過程體外受精必須借助胚胎移植實現(xiàn)“試管嬰兒的繼續(xù)發(fā)育”轉(zhuǎn)基因及動物生物反應(yīng)器的研究也必須借助胚胎移植第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五二、胚胎分割技術(shù)1）概念

采用顯微手術(shù)（機(jī)械方法）的方法將早期胚胎分割成2分胚，4分胚或8分胚，經(jīng)體內(nèi)或體外培養(yǎng)后植入受體，以得到同卵雙胎或同卵多胎的技術(shù)

胚胎分割以增加優(yōu)秀遺傳性狀的動物數(shù)量為主要目的，可提高胚胎移植技術(shù)的效率和效益第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五選擇良好的桑椹胚或囊胚移入培養(yǎng)皿中，用分割針或分割刀片將其切開，吸出其中的半個胚胎注入透明帶中或直接移植給受體2)基本過程：第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3）胚胎分割的理論依據(jù)大多數(shù)哺乳動物早期胚胎屬調(diào)整發(fā)育類型，去掉早期胚胎的一半，剩余的部分仍發(fā)育成完整的胚胎，至少在8細(xì)胞前，每個分裂球都有相同的發(fā)育能力到晚桑椹胚時，胚胎發(fā)生初步分化，這時進(jìn)行胚胎分割，可以重新發(fā)育到囊胚第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五4）特點(diǎn):

后代具有相同的遺傳物質(zhì)胚胎克隆5）使用的主要儀器：實體顯微鏡和顯微操作儀6）應(yīng)用:

為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、性別控制技術(shù)提供活胚材料第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五注意：①對囊胚階段的胚胎進(jìn)行分割時，要將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割原因：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)一般到囊胚階段才出現(xiàn)，它是發(fā)育為胚胎本身的基礎(chǔ)細(xì)胞，其他細(xì)胞為滋養(yǎng)細(xì)胞，只為胚胎和胎兒發(fā)育提供營養(yǎng)。若分割時不能將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)均等分割，會出現(xiàn)含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)多的部分正常發(fā)育的能力強(qiáng)，少的部分發(fā)育受阻或發(fā)育不良，甚至不能發(fā)育等問題第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五②胚胎分割技術(shù)也是動物克隆的方法之一③胚胎分割的份數(shù)越多，操作的難度會越大，移植的成功率也越低早期胚胎的體積很小，只有在顯微鏡下才能看到細(xì)胞數(shù)目是有限的：分割的份數(shù)越多，不但難以做到均等分割，每一份的細(xì)胞數(shù)會越少，作為囊胚期的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞所受的影響會更大分割的份數(shù)越多，技術(shù)的難度會越大，移植后的恢復(fù)和發(fā)育的難度會越大，移植成功率自然會降低第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五④透明帶對于分割胚體內(nèi)外發(fā)育的影響透明帶作用：阻止異種動物精子受精和同種動物的多精子受精，保護(hù)受精卵在輸卵管和子宮內(nèi)正常運(yùn)行，防止輸卵管和子宮液的傷害及白細(xì)胞的吞噬，并使分裂階段的卵裂球相互靠近，不致分離胚胎分割時所處的發(fā)育階段，對透明帶的依賴性越強(qiáng)第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五⑤冷凍胚胎的影響分割過程引起的透明帶損傷和胚胎細(xì)胞數(shù)量減少，經(jīng)冷凍和解凍在體內(nèi)和體外的發(fā)育能力進(jìn)一步降低，其移植妊娠率低于完整的冷凍胚胎第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五三、胚胎嵌合體由兩個或兩個以上具有不同遺傳性狀的細(xì)胞或細(xì)胞系組成的聚合胚發(fā)育而成的個體原發(fā)性嵌合體次生型嵌合體第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1、方法囊胚注入法在動物胚胎發(fā)育到囊胚時，將目的細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)注入囊胚腔，使之與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)結(jié)合并發(fā)育，最終得到嵌合體個體第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五聚合法全胚聚合法將發(fā)育到一定時期的胚胎，去掉透明帶后，將兩個或兩個以上的胚胎聚合在一起，形成一個胚胎后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至囊胚，再植入受體動物體子宮內(nèi)卵裂球聚合法去掉透明帶后將胚胎打散，從雙方胚胎卵裂球中各取出一部分細(xì)胞進(jìn)行聚合，培養(yǎng)后移植第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2、影響因素胚胎的質(zhì)量與狀態(tài)A級和B級胚胎胚胎的發(fā)育時期多采用8細(xì)胞早期胚胎聚合第五十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

四、胚胎細(xì)胞核移植將未著床的早期胚胎分散成單個的細(xì)胞，用電融合方法，使單個細(xì)胞與去除細(xì)胞核的未受精的成熟的卵母細(xì)胞融合，體外培養(yǎng)發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)子已在小鼠、兔、山羊、牛、猴等動物上成功第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五五、性別控制與胚胎性別鑒定動物的性別控制(sexcontrol)技術(shù)是通過對動物的正常生殖過程進(jìn)行人為干預(yù)，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門生物技術(shù)X、Y精子分離技術(shù)：流式細(xì)胞儀胚胎性別診斷第五十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五

早期胚胎的性別鑒定1）核型分析：分析部分胚胎細(xì)胞的染色體的組成2）SRY片段的PCR擴(kuò)增Y染色體上的特異片段第五十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五3）H-Y抗原：雄性特異性弱組織相容性Y抗原只有Y精子才能表達(dá)H-Y抗原利用H-Y抗體檢測精子質(zhì)膜上存在的H-Y抗原，再通過一定的分離程序，就能將精子分離成H-Y+(Y精子)和H-Y-(X精子)兩類，將所需性別的精子進(jìn)行人工受精，即可獲得預(yù)期性別的后代測定胚胎上H-Y抗原的存在與否對胚胎的性別作出鑒定第五十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五意義通過控制后代的性別比例，可充分發(fā)揮受性別限制的生產(chǎn)性狀(如泌乳)和受性別影響的生產(chǎn)性狀(如生長速度、肉質(zhì)等)的最大經(jīng)濟(jì)效益控制后代的性別比例可增加選種強(qiáng)度，加快育種進(jìn)程控制胚胎性別還可克服牛胚胎移植中出現(xiàn)的異性孿生不育現(xiàn)象，排除伴性有害基因的危害第五十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五六、早期胚胎培養(yǎng)發(fā)育阻斷：早期胚胎停頓在某個特定發(fā)育時期，不能繼續(xù)發(fā)育時間隨動物種不同而異培養(yǎng)條件不完備添加各種生長因子可促進(jìn)胚胎發(fā)育與某些體細(xì)胞共同培養(yǎng)飼養(yǎng)性細(xì)胞，通過分泌某些有利于胚胎發(fā)育所需的營養(yǎng)因子第五十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)體外受精體外受精(InVitroFertilization)是指哺乳動物的精子和卵子在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術(shù)，英文簡稱為IVF在生物學(xué)中，把體外受精胚胎移植到母體后獲得的動物稱試管動物(test-tubeanimal)第五十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五人工授精(AI)第五十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五一、基本原理：人工模擬體內(nèi)環(huán)境（包括營養(yǎng)、溫度、pH等），使初級卵母細(xì)胞成熟，同時使精子獲能，最終完成受精作用，并有計劃地保存胚胎第五十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五二、體外受精技術(shù)發(fā)展的歷史

體外受精研究有100多年歷史1878年德國Sehenk在家兔和豚鼠進(jìn)行了嘗試1954年張民覺獲得首例體外受精兔1963年金黃倉鼠體外受精獲得成功，開創(chuàng)了精子體外獲能成功的先例1990年我國錢菊芬獲得首例試管山羊旭日干、范必勤等獲得試管牛犢第六十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五三、意義體外受精技術(shù)對動物生殖機(jī)理研究、畜牧生產(chǎn)、醫(yī)學(xué)和瀕危動物保護(hù)等具有重要意義在家畜品種改良中，體外受精技術(shù)為胚胎生產(chǎn)提供了廉價而高效的手段，對充分利用優(yōu)良品種資源，縮短家畜繁殖周期，加快品種改良速度等有重要價值哺乳動物胚胎移植、克隆、轉(zhuǎn)基因和性別控制等現(xiàn)代生物技術(shù)不可缺少的組成部分第六十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五四、體外受精技術(shù)環(huán)節(jié)卵母細(xì)胞的獲得和體外成熟精子的體外獲能成熟卵母細(xì)胞與獲能精子的體外受精受精卵的體外培養(yǎng)受精卵的移植第六十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五體外受精獲能次級卵母細(xì)胞

減數(shù)第二次分裂中期第六十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五1．卵母細(xì)胞的獲得與體外成熟1）卵細(xì)胞的采集方法獲得足夠數(shù)量的卵母細(xì)胞是生產(chǎn)試管動物的前提（1）從屠宰場家畜卵巢中采集（2）從超數(shù)排卵的卵巢獲得卵泡,借助腹腔鏡，手術(shù)法取卵（3）陰道超聲波監(jiān)視穿刺法直接從牛卵巢收集卵母細(xì)胞和內(nèi)窺鏡借助套筒穿刺陰道穹隆獲得第六十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期五2）卵母細(xì)胞的成熟未成熟的卵母細(xì)胞的核在細(xì)胞中央，成熟過程中遷移到動物極質(zhì)膜下，核變得膨大，改稱發(fā)生泡，接著進(jìn)行第一次成熟分裂，減數(shù)分裂的完成標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟（1）細(xì)胞核成熟