原位雜交組織化學

原位雜交組織化學第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五原位雜交組織化學（ISHH）原理：用標記的DNA或RNA為探針，在原位檢測組織細胞內(nèi)特定核酸序列的方法。特點：雜交在載玻片上的細胞進行。分類：根據(jù)所用探針和靶核苷酸不同--DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交根據(jù)探針標記物是否直接被檢測—

直接法、間接法第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五一原位雜交的由來與發(fā)展

（一）核酸分子雜交技術(shù)

按其作用方式大致分為液相雜交和固相雜交兩種液相雜交：參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。液相分子雜交技術(shù)包括：①吸附雜交②發(fā)光液相雜交③液相夾心雜交④復性速率液相分子雜交第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五固相雜交：是將參加反應的一條核酸鏈固定在固體的支持物上常用的有硝酸纖維素濾膜，其它如尼龍膜、乳膠顆粒和微孔板等），另一條參加反應的核酸鏈游離在溶液中。固相雜交技術(shù)包括：①菌落原位雜交②斑點雜交法③Southern印跡雜交④Northern印跡雜交⑤組織原位雜交第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（二）原位雜交技術(shù)的發(fā)展在近20年飛躍發(fā)展的突出特點：①由分子遺傳學研究提供的探針大量增加；②探針生產(chǎn)的可靠性和速率大大發(fā)展了；③非放射性標記物的發(fā)展使原位雜交技術(shù)成為實驗室的常規(guī)技術(shù)和臨床日常應用的診斷技術(shù)。④新的非放射性標記技術(shù)正在繼續(xù)不斷涌現(xiàn)。第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五二原位雜交組織化學基本技術(shù)原位雜交的基本方法和應用原則：①雜交前準備，包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強核酸探針的穿透性、減低背景染色等；②雜交；③雜交后處理；④顯示（visualization）：放射性自顯影顯色、非放射性標記顯色第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（一）原位雜交的基本要求1固定2玻片和組織切片的處理3雜交4雜交后處理5顯示6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

1固定

固定劑的應用和選擇原則：①保持細胞結(jié)構(gòu)；②最大限度地保持細胞內(nèi)DNA或RNA水平；③使探針易于進入細胞或組織。DNA：比較穩(wěn)定，對于DNA的定位來說，固定劑的種類和濃度并不十分重要。RNA：易被降解，在RNA的定位上，要使RNA的降解減少到最低限度，固定劑的種類、濃度和固定的時間十分重要，而且取材后應盡快予以冷凍或固定。第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五固定劑：多聚甲醛、醋酸-酒精混合液、Bouin’s固定劑、Carnoy’s液

優(yōu)缺點：

沉淀性固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液能增加核酸探針的穿透性，但不能最大限度地保存RNA，且對組織結(jié)構(gòu)有損傷。

戊二醛：能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而影響了核酸探針的穿透性。多聚甲醛：仍被公認為ISHH較為理想的固定劑。第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

多聚甲醛——mRNA的定位

將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機或振蕩切片機切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會影響雜交結(jié)果。第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五病理學活檢取材——

福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標本對檢測DNA和mRNA有時也可獲得雜交信號。石蠟包埋切片——

由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片，同時，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。冷凍切片——

應用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五2玻片和組織切片的處理

（1）玻片的處理熱肥皂刷洗自來水清洗清潔液中浸泡24h清水洗凈烘干95%酒精中浸泡24h蒸餾水沖洗烘干

烘箱溫度＞150℃過夜以去除RNA酶蓋玻片硅化處理錫箔紙包裹無塵存放第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（2）增強組織的通透性和核酸探針的穿透性根據(jù)應用固定劑種類、組織種類、切片厚度和核酸探針長度而定。

常用方法：稀釋的酸洗滌、去垢劑或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶等。

優(yōu)點:

通過去蛋白作用增強組織通透性和探針的穿透性,提高雜交信號.

缺點:

減低RNA的保存,影響組織結(jié)構(gòu)形態(tài).因此，在用量及孵育時間上應慎為掌握。第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（3）減低背景染色

預雜交（Prehybridization）:

是減低背景染色的一種有效手段。預雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預雜交液中可達到封閉非特異性雜交點的目的，從而減低背景染色。雜交后洗滌:

采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，去除殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（4）防止RNA酶的污染①在整個雜交前處理過程都需戴消毒手套。②所有實驗用玻璃器皿及鑷子都應于實驗前一日置高溫烘烤——消除RNA酶,亦可用消毒鍋。③要破壞RNA酶，最低溫度必須在150℃左右。④消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標記和防止取出時空氣污染。⑤雜交前及雜交時所用的溶液需經(jīng)高壓消毒處理。第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五3雜交（Hybridisation）雜交:核酸探針進入細胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個環(huán)節(jié)。

雜交方式:是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。

加蓋片的目的

防止孵育過程中的高溫（50℃左右）導致雜交液的蒸發(fā);

硅化的蓋玻片的優(yōu)點是清潔無雜質(zhì)，光滑,無氣泡,不會影響組織切片與雜交液的接觸;

蓋玻片自身重量能與雜交液吸附達到覆蓋和防蒸發(fā)的作用。第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五雜交注意環(huán)節(jié)（1）探針的濃度原則:探針濃度必須給予該實驗最大的信/噪比值。最佳原則應是應用最低探針濃度以達到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。雜交液的量要適當:以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多浪費，且液量過多常易致蓋玻片滑動脫落,過量的雜交液含核酸探針濃度過高，易導致高背景染色等后果。第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

（2）探針的長度

最佳長度應在50～100個堿基之間。探針短---易進入細胞，雜交率高，雜交時間短。

500個堿基的探針---雜交時間約需20h左右。

200～500個堿基的探針---可應用.

超過500個堿基的探針---在雜交前最好用堿或水解酶進行水解，使其變成短的片段，達到實驗所需求的堿基數(shù)。第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

（3）雜交的溫度和時間

雜交溫度：

DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進行雜交。原位雜交中，DNA、RNA探針需要的Tm分別是90℃、95℃，這種高溫對保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交液中加入鹽和甲酰胺，減低Tm。根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異。

第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五雜交時間：

16-20h或孵育過夜甲酰胺：在雜交液中占50%左右；調(diào)節(jié)雜交反應溫度，利于保持組織形態(tài)結(jié)構(gòu)；防止低溫時非同源性片段結(jié)合；但具有破壞氫鍵的不穩(wěn)定作用。硫酸葡聚糖：在核酸雜交液中硫酸葡聚糖占10%左右；是一種大分子的多聚胺化合物，具有極強的水合作用，因而能大大增加雜交液的粘稠度；促進雜交率，特別是對雙鏈核酸探針。甲酰胺和硫酸葡聚糖：第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

（4）雜交嚴格度（Hybridizationstringency）

雜交嚴格度：表示通過雜交及沖洗條件的選擇對完全配對及不完全配對雜交體的鑒別程度。錯配對雜交的穩(wěn)定性較完全配對雜交體差，因此，通過控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強，但敏感性降低，反應亦然。低嚴格度：雜交及沖洗條件在Tm35–40℃之間，高鹽或低甲酰胺濃度。大約有70%～90%的同源性核苷酸序列被結(jié)合，可導致非特異性雜交信號的產(chǎn)生。中嚴格度：Tm20-30℃的范圍。高嚴格度：為Tm10-15℃，低鹽和高甲酰胺濃度。只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成穩(wěn)定的結(jié)合。第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五4雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度的鹽溶液的漂洗。目的：通過雜交后的洗滌將組織切片中非堿基配對除去，有效地減低背景染色，獲得較好的反差效果。洗滌的條件：如鹽溶液的濃度、溫度、洗滌次數(shù)和時間因核酸探針的類型和標記的種類不同而略有差異，一般遵循的共同原則是鹽溶液濃度由高到低，而溫度則由低到高。注意事項：漂洗過程中切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很難減少非特異性結(jié)合，從而增強了背景染色。放射性標記探針雜交后漂洗過程中可用底片曝光的方法測背景染色作為改善漂洗程序的指針。第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五5顯示Visualization

又稱檢測系統(tǒng)Detectionsystem根據(jù)核酸探針標記物的種類分別進行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進行不同顯色處理。放射自顯影：

圖象分析儀檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。

非放射性核酸探針雜交的細胞或組織：

酶檢測系統(tǒng)顯色顯微分光光度計或圖像分析儀檢測。第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五6對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷①Northern和Southern印跡雜交法。②可用結(jié)合的免疫組織化學和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽）水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應mRNA共存于同一細胞中。

③預先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。事先與特異性的cRNA或cDNA進行雜交。再進行ISHH，其結(jié)果應為陰性。由于同一RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應用其進行ISHH，結(jié)果應為陰性。④檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應在無標記探針的情況下進行。多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五（二）核酸探針1核酸探針的種類2探針的標記與應用第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五1核酸探針的種類

（1）按標記方式分類

直接法和間接法：１）直接標記探針

應用藕聯(lián)異硫氰酸熒光素（FITC）或羅丹明Rhodamine等熒光物質(zhì)的dNTP或NTP直接標記探針，雜交洗滌后即可在顯微鏡下檢測。

２）間接標記探針采用生物素或地高辛等半抗原分子作為分子標記探針，雜交洗滌后分別用抗生物素抗體和抗地高辛抗體作為配體進行檢測，配體上分別連有不同的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察分析。第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五兩種方法的比較：（1）直接標記的DNA探針雜交后經(jīng)過簡單洗滌就可顯示雜交信號，簡單方便，而間接標記的探針雜交后需通過繁瑣的檢測步驟；（2）間接標記的探針可進行多步驟信號放大，但其受配基親和力的影響。而直接標記的信號放大一般受到限制，目前多用Dupon公司的TSA系統(tǒng)進行直接標記信號的放大。（3）對于多色FISH，往往選擇直接標記法標記探針。第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

（2）按核酸性質(zhì)分類

①DNA探針②cDNA探針③RNA探針④寡核苷酸探針（3）按染色體上位置分類：①重復序列探針②涂染探針③基因探針及其它第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五2探針的標記與應用

切口平移法（Nicktranslation）隨機引物法(RandomPrimer)末端標記法PCR標記法體外轉(zhuǎn)錄標記法不同模板需不同標記方法第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五

生物素標記cRNA探針

在原位雜交組織化學中的應用1光敏生物素標記cRNA探針的應用2酶促生物素標記cRNA探針的應用第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五1光敏生物素標記cRNA探針的應用

光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上，屬于化學修飾法，此方法簡單；成本低；適用于大量制備（>50ug）。光敏生物素試劑種類：

光生物素（乙酸鹽）補骨脂素生物素。生物素-聚乙二醇-當歸素（BPA）：在長波UV下它可與DNA堿基共價鍵結(jié)合。BPA反應物與DNA結(jié)合比光敏生物素更特異，在可見光下它不與核酸反應，這個特異性可使BPA只標記粗制細胞裂解物中的核酸，而不標記蛋白、多糖和其他細胞大分子。第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序如下：１石蠟切片脫蠟入水后，PBS洗；冰凍切片直接入PBS洗。２0.1mol/L甘氨酸PBS洗5min。３0.4%TrixtionX-100PBS洗15min。４1ug/ml蛋白酶K，37℃保溫30min。５4%多聚甲醛PBS固定。６0.1mol/LPBS洗2×3min。７0.25%乙酸酐10min。８2×SSC洗10min。９取10ul含相應探針的雜交液滴于標本上，如果是cDNA探針，則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上冰浴冷卻，然后再用。10蓋上硅化蓋玻片或蠟膜，43℃濕盒保溫12—16h。第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五114×SSC洗脫蓋片，并在同一液中，37℃漂洗10-30min。122×SSC（含20ug/mlRNaesA，適于RNA探針）37℃洗30min。131×SSC，0.1×SSC，37℃各漂洗10-30min。140.05mol/LPBS洗4×5min。153%BSA（0.4%TritonX-100PBS配）37℃保溫30min。16堿性磷酸酶室溫1~3h。170.05mol/LPBS洗4×5min。18緩沖液Ⅰ洗2×5min。19緩沖液Ⅱ洗2×5min。20NBT/BCIP液顯色，室溫，暗處3h。2120mmol/LEDTA，pH8.0終止顯色。22甘油明膠直接封片。第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五2酶促生物素標記cRNA探針的應用原理：酶促生物素標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸摻入到探針DNA中，制成標記探針，敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，成本高。反應步驟如下：①用PBS沖洗黏附有切片的載玻片。②將載玻片浸入0.3%H2O2，以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。③PBS洗2×3min，加入抗生物素血清和正常山羊血清，室溫1h或4℃過夜。④PBS洗2×3min。第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五⑤加生物素化室溫30min孵育。⑥PBS洗2×3min。⑦應用ABC復合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合，室溫孵育1h。⑧PBS洗2×3min。⑨DAB溶液孵育3-15min。⑩水洗，復染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。第三十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五地高辛標記cRNA探針的應用第三十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期五地高辛標記cRNA探針的應用原理：

地高辛（Dig）為類固醇半抗原，僅存在于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物無交叉反應，地高辛標記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP）上形成Dig-11-dUTP。通過隨即引物或缺口平移法，將Dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成Dig-配基標記的核酸探針。

將這種標記的探針與組織、細胞或染色體原位