westernblot與蛋白質(zhì)雙向電泳的原理方法及應(yīng)用課件

錄westernblot原理及方法蛋白質(zhì)雙向電泳原理及方法第一.基本原理通過(guò)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，以固相載體上的這些蛋白質(zhì)或者多肽作為抗原與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)再與酶或者同位素標(biāo)記的第二抗體起作用，通過(guò)底物顯色或者放射自顯影來(lái)檢測(cè)特定基因表達(dá)的蛋白質(zhì)PAGE分離蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移一抗，二抗雜交底物顯色或者放射自顯影二.具體的方法和步驟品制與

凝膜與交與色I(xiàn).蛋白質(zhì)樣品制備1.向細(xì)胞懸液中加入蛋白酶抑制劑2.細(xì)胞裂解液破碎細(xì)胞（原理是表面活性劑的兩親性）3.水溶液或者有機(jī)溶劑提?。ê笳哌m用于非極性側(cè)鏈多的蛋白）4.層析或者電洗脫制備目的蛋白II.SDS—PAGE電泳問(wèn)：什么決定了蛋白質(zhì)能走多遠(yuǎn)？首先明白：決定蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)快慢的是蛋白質(zhì)帶電量和蛋白質(zhì)的質(zhì)量那么：此處是什么起決定作用?SDS所帶電荷極多蛋白質(zhì)電荷相比之下可以忽略按體重分電荷III.轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜兩種方法1.半干法：2.濕法注意事項(xiàng)：IV.封閉封閉是什么?為什要要進(jìn)行封閉？V.雜交問(wèn)：什么是一抗，二抗？一抗是指對(duì)待測(cè)蛋白有免疫反應(yīng)的抗體二抗是指對(duì)一抗有免疫反應(yīng)的抗體（把一抗當(dāng)做抗原）問(wèn)：為什么要進(jìn)行兩次免疫反應(yīng)?1.信號(hào)放大，因?yàn)橐豢箍梢越Y(jié)合多個(gè)二抗2.價(jià)格便宜，一種二抗可以對(duì)多種一抗起作用，只需要找到可以使用的二抗即可3.可以有較多的選擇，而且，帶標(biāo)記的二抗可以直接購(gòu)買(mǎi)缺點(diǎn)：二次免疫導(dǎo)致的非特異性條帶可能影響結(jié)果VI.顯色第實(shí)驗(yàn)原理第一向：等點(diǎn)聚焦電泳

（IEF，isoelectricfocusing）第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）等電聚焦電泳在凝膠（常用聚丙烯酰胺凝膠）中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時(shí)，兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步增加的pH梯度，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)放進(jìn)此體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到或聚焦于與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。?

樣品制備?

圖像處理分析樣品制備l

雙向電泳的最關(guān)鍵步驟之一l

原則：盡可能多地提取總蛋白質(zhì)，盡可能簡(jiǎn)單的操作步驟，防止樣品提取過(guò)程中的化學(xué)修飾，去除樣品中核酸、鹽離子等干擾物質(zhì)l

增加樣品溶解性的方法：①變性劑，使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露，降低接近疏水殘基的能量域。如尿素、硫脲等②表面活性劑，可溶解疏水基團(tuán)，如離子去污劑SDS，非離子去污劑NP-40及兩性離子去污劑CHAPS，其中CHAPS最好理胞（清洗等）將樣品與水化上樣緩沖液混合，體積比約為1:4混合物加入膠條槽在膠條上覆蓋適量礦物油，蓋上蓋將膠條槽平放在電泳儀上，對(duì)好正負(fù)極，設(shè)定等電聚焦程序IPG膠條平衡l

將膠條放入平衡緩沖液Ⅰ中，振蕩15分鐘l

將膠條放入平衡緩沖液Ⅱ中，振蕩15分鐘l

用去離子水潤(rùn)洗膠條1秒，用濾紙?jiān)谀z條邊緣吸去多余水分平衡緩沖液Ⅰ：--含DTT（二硫蘇糖醇）--使變性的非烷基化蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)平衡緩沖液Ⅱ：--含碘乙酰胺--使蛋白質(zhì)巰烷基化，防止其在電泳過(guò)程中重新氧化第二向SDS硝酸銀染色第過(guò)敏原檢測(cè)及方法建立

由于許多過(guò)敏原是來(lái)著生物體的機(jī)體，尤其表現(xiàn)在蛋白質(zhì)上。

例如魚(yú)類。魚(yú)類是最常見(jiàn)的易引起過(guò)敏反應(yīng)的食物，而小清蛋白是最常見(jiàn)的過(guò)敏原。在建立魚(yú)小清蛋白檢測(cè)及方法建立過(guò)程中利用westernblot法完成免疫鑒定，為低免疫產(chǎn)品研制生產(chǎn)提供理論依據(jù)。診斷寄生蟲(chóng)病

利用westernblot法進(jìn)行寄生蟲(chóng)病檢測(cè)一般從寄生蟲(chóng)特異抗原入手，檢測(cè)人體液內(nèi)相關(guān)蛋白的含量，以確定是否感染寄生蟲(chóng)病。

優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，始于用于疑似病人的診斷，但是由于費(fèi)用高昂，費(fèi)時(shí)且技術(shù)要求高所以建議做推廣但不建議普及。一般檢測(cè)常用ELISA檢測(cè)。

應(yīng)用病例：診斷囊蟲(chóng)病：運(yùn)用DNA重組技術(shù),構(gòu)建來(lái)源于豬囊尾蚴的cDNA表達(dá)文庫(kù),以囊蟲(chóng)病患者血清及病豬血清為抗體,從中篩選出4個(gè)特異性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,這些抗原克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo),形成β-半乳糖苷酶-豬囊尾蚴特異性抗原的融合蛋白(fusionprotein,FP)。診斷人顎口線蟲(chóng)?。翰捎肳estern印跡技術(shù)檢測(cè)顎口線蟲(chóng)特異的相對(duì)分子質(zhì)量為21000和24000抗原蛋白條帶，結(jié)果

Western印跡法檢測(cè)顎口線蟲(chóng)患者血清,均可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為24000的條帶,7份可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量為21000的條帶。檢測(cè)基因產(chǎn)物表達(dá)及水平

利用westernblot檢測(cè)基因產(chǎn)物的表達(dá)水平一般應(yīng)用于腫瘤，糖尿病的由于機(jī)體自身病變的疾病診斷中。

應(yīng)用病例：成人隱匿型糖尿?。和ㄟ^(guò)免疫印跡四聯(lián)檢測(cè)試劑條對(duì)319例2型糖尿病患者進(jìn)行糖尿病自身抗體[谷氨酸脫羧酶抗體（GAD）、胰島細(xì)胞抗體（ICA）、胰島素抗體（IAA）、酪氨酸磷酸化酶自身抗體（IA‐2）]檢測(cè)，顯著高于單一抗體檢測(cè)。結(jié)論檢測(cè)血清GAD、IA‐2、IAA、ICA能夠?yàn)長(zhǎng)ADA的早期診斷提供依據(jù)，同時(shí)更好地進(jìn)行病情評(píng)估和治療方案的調(diào)整。胃癌診斷：采用免疫印跡檢測(cè)NOTUM蛋白及β-catenin蛋白的表達(dá)量,使用SPSS進(jìn)行相關(guān)性分析確定NOTUM蛋白與β-catenin蛋白之間的關(guān)系，確定胃癌發(fā)展情況。檢測(cè)病毒感染

檢測(cè)病毒感染有兩個(gè)應(yīng)用方向：疾病診斷與血液篩選。

疾病診斷例：風(fēng)疹病毒(ＲＶ)能夠引起先天感染。通過(guò)孕婦傳播,致使胎兒先天畸形或?qū)е孪忍煨燥L(fēng)疹綜合征如先天性心臟病、智力低下等。因此能夠早期快速診斷對(duì)于優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)

、預(yù)防后天及再感染具有重要意義。目前臨床上所用的ELISA檢測(cè)試劑盒所包被抗原為全細(xì)胞粗制抗原

,特異度低、靈敏度差,缺乏統(tǒng)一的抗原標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)可采用Western-blot的方法,測(cè)定風(fēng)疹病毒的主要抗原性蛋白,以指導(dǎo)臨床應(yīng)用

。作用雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用，可用于研究樣品總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達(dá)差異、蛋白質(zhì)問(wèn)相互作用、蛋白質(zhì)修飾等。病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以了解其毒性因子、致病機(jī)理以及藥物抗性等方面，對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)防非常重要。②蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)可作為致病微生物臨床隔離群區(qū)分的可靠參數(shù)0102床分離的遺傳背景相同的菌株出現(xiàn)了新的ORF，對(duì)臨床分離株NCTC8143進(jìn)行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)色氨酸酶的含量較高，而實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的菌株中則沒(méi)有色氨酸酶。

雙向電泳技術(shù)在病原微生物藥物抗性基因功能研究中的應(yīng)用

雙向電泳技術(shù)可以進(jìn)行微生物抗性機(jī)理的研究。

Diffes等對(duì)DivercinV4l抗性和野生型的產(chǎn)單核細(xì)胞

李斯特氏菌進(jìn)行2-DE分析，發(fā)現(xiàn)至少在17個(gè)蛋白質(zhì)存在差異，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9個(gè)蛋白質(zhì)，而新增8個(gè)蛋白質(zhì)，其中只有1個(gè)Rl是存在于已知該菌的數(shù)據(jù)庫(kù)中，為鞭毛蛋白；機(jī)會(huì)致病真菌如念珠菌屬產(chǎn)生了許多的耐藥菌株。

伊曲康唑類化合物通過(guò)抑制真菌細(xì)胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且對(duì)耐真菌藥物的菌株起作用。Bruneau等對(duì)比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3種殺真菌藥處理所產(chǎn)生的白色念珠菌雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜后認(rèn)為，氟康唑和伊曲康唑在蛋白質(zhì)組水平具有共同的作用機(jī)制。

因此，病原微生物的耐藥菌株和敏感菌株的雙向電泳研究，對(duì)闡明耐藥相關(guān)機(jī)制、鑒定新的藥物靶位和耐藥診斷標(biāo)志有非常重要的價(jià)值。2.雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展人們通過(guò)雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展。腫瘤發(fā)生的早期常常無(wú)任何癥狀，而只有在轉(zhuǎn)移時(shí)才容易被發(fā)現(xiàn)，這往往導(dǎo)致延誤了治療的最佳時(shí)期。因此找到腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行及時(shí)的診斷和治療顯得尤為重要。3.雙向電泳技術(shù)在藥物作用機(jī)制研究的進(jìn)展雙向電泳技術(shù)的出現(xiàn)，為動(dòng)態(tài)、高通量的研究藥物作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力的