microRNA定量研究實驗指南

1HaiGenemiRNA定量整套解決方案----miRNA提取、反轉(zhuǎn)錄、 RealTimePCR前言AmiRNA進(jìn)展定量爭論的經(jīng)典方法是ABImiRNA進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄，之后承受MGB探針進(jìn)展RealTimePCR定量分析，這種方法具有特異性高、定量準(zhǔn)確的優(yōu)點，但是試驗需要訂購ABI公司的成套的引物試劑，本錢很高。2023SoroushmiR-Q技術(shù)【1tag的特異miRN〔原理如圖12023年P(guān)eter對miR-Q2miRNA進(jìn)展加AtagoligodTRealTimePC〔原理如圖1B，這樣保證了miRNA的擴增特異性，其可以很好的區(qū)分單個堿基差異的miRN【結(jié)果如圖2所miRNA進(jìn)展定量爭論，其結(jié)果的牢靠性可比較探針法【結(jié)33~13ABB1AmiR-Q1BPetermiR-Q技術(shù)原理2Peter改進(jìn)的技術(shù)能夠有效的區(qū)分相像度很高的miRNAs3PetermiRNAsmiRNAPeter改進(jìn)的技術(shù)方法根底上建立起來的，包括三局部：高效提取miRNA、通過加A法反轉(zhuǎn)錄獲得miRNA的cDNA、應(yīng)用SYBRGreen染料法對獲得的cDNA產(chǎn)物進(jìn)展RealTimePCR擴增。承受該試驗方案進(jìn)展miRNA4所示。下面將該方案的使用特點和方法進(jìn)展具體闡述。4HaiGenemiRNAqRealTimePCR定量方案第一步miRNA的提取核酸的提取往往是爭論過程的第一步、是試驗的根底。核酸提取的成功與否、提取質(zhì)量的凹凸對后續(xù)試驗起著至miRNA的提取主要承受三種方法：Trizol法使用TRIzol試劑提取總RNA，對總RNA中包含的局部小RNA進(jìn)展?fàn)幷?，該方法的缺點是總RNA中miRNA的比例較小，同時由于mRNA的干擾，會導(dǎo)致后續(xù)反轉(zhuǎn)錄和RealTimePCR試驗效率很低，很難獲得抱負(fù)的試驗結(jié)果，而且結(jié)果并不行靠。離心柱式法利用特別的吸附材料將總RNAmRNAmiRNA洗脫下來，miRNA。由于miRNA分子較小〔20nt左右〕所以其吸附基質(zhì)的力氣較差，從而導(dǎo)致提取效率很20nt左右的miRNA分子大量喪失。HaiGene全一代miRNA提取法HaiGene公司研發(fā)團隊在探究miRNA分子功能的過程中，開發(fā)出一套全的miRNA提取方案?？芍苯訌募?xì)胞、組織、全血等材料中提取純度高達(dá)97的miRN15-200n，并且其提取過程中可獲得更多的小分子miRN，少量的樣品也可獲得抱負(fù)的試驗結(jié)果。更為重要的是，該方法操作極為簡潔、步驟較少、適合于高通量提取，2h內(nèi)可完成24個樣品的提取工作。承受HaiGenemiRNA提取試劑盒提取高純度小RNA操作方法【HaiGene，Cat.No.:B1801】組織樣本提取1.5mlEP300μlmiRNAReagent10μlβ-巰基乙醇，混合均勻。在液氮條件下充分將組織研磨粉碎〔見樣本使用量表研磨成粉狀的組織參與到上述300μlmiRNAReagentA中，馬上手腕用力震蕩至組織粉末徹底溶解于裂解液中。室溫靜置5min以充分裂解細(xì)胞。留意：將組織參與到miRNAReagentA后要快速將組織震散，否則易引起組織成團狀，不簡潔裂解。如發(fā)生成團狀，務(wù)必用移液器將團狀組織吹打松散。向上述裂解完畢的裂解液中參與350μlmiRNAReagentB，手腕用力震蕩混合均勻，室溫放置5min。13,000rpm5min550ul1.5mlEP管中。向上述溶液中參與200μl無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，4℃放置5min。13,000rpm10min700ul1.5mlEP管中。向上述溶液中參與700μl異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次，于-20℃放置30min。13,000rpm15minRNA沉淀。留意：由于小RNA總質(zhì)量上含量較低，絕大多數(shù)狀況下肉眼無法看到白色沉淀。向沉淀中每管參與1ml75異丙醇洗液〔切勿用75%乙醇代替13,000rpm離心2minRNA沉淀。倒掉洗液，可再次短離心10s后，用1lTip頭吸干剩余的洗液，置于室溫使異丙醇揮發(fā)干凈〔10～20min。留意：a.該步驟中務(wù)必使異丙醇揮發(fā)干凈，否則會導(dǎo)致RNA溶解不徹底；b.不能使用加熱裝置對EP管進(jìn)展加熱揮發(fā)。(12)50～100μlRnaseFreeTEBufferRNA。細(xì)胞樣本提取貼壁細(xì)胞：胰酶消化細(xì)胞后，離心收集細(xì)胞沉淀。用100μl1×PBS300μlmiRNAReagentA顛倒混合5min。100μl1×PBS300μlmiRNAReagentA顛倒混合均勻，室5min。全血：使用淋巴細(xì)胞分別液，分別出100ul白細(xì)胞，參與到300μlmiRNAReagentA顛倒混合均勻，室溫放置5min。將上述裂解液中參與250μlmiRNAReagentB，手腕用力震蕩混合均勻，室溫放置5min。miRNAReagentB總體積數(shù)為350μl。如參與50μl細(xì)胞，則miRNAReagentB使用300μl。13,000rpm5min550ul1.5mlEP管中。向上述溶液中參與200μl無水乙醇，手腕用力震蕩數(shù)次，4℃放置5min。13,000rpm10min700ul1.5mlEP管中。向上述溶液中參與700μl異丙醇，手腕用力上下顛倒數(shù)次，于-20℃放置30min。13,000rpm15minRNA沉淀。留意：由于小RNA總質(zhì)量上含量較低，絕大多數(shù)狀況下肉眼無法看到白色沉淀。向沉淀中每管參與1ml75%異丙醇洗液〔切勿用75%乙醇代替，輕柔地上下顛倒數(shù)次，13,000rpm離心2minRNA沉淀。倒掉洗液，可再次短離心10s后，用1lTip頭吸干剩余的洗液，置于室溫使異丙醇揮發(fā)干凈〔10～20min。留意：a.該步驟中務(wù)必使異丙醇揮發(fā)干凈，否則會導(dǎo)致RNA溶解不徹底；b.不能使用加熱裝置對EP管進(jìn)展加熱揮發(fā)。50～100μlRnaseFreeTEBufferRNA。AmiRNAcDNA【HaiGene，Cat.No.:D1801】HaiGene公司開發(fā)出一套全的一步法miRNAPeter改進(jìn)的miR-QmiRNA同時完成加A反響和反轉(zhuǎn)錄反響，直接獲得含有特異性tag15(T)cDNA產(chǎn)物〔如圖5所示。該方法使得miRNA反轉(zhuǎn)錄和mRNA的反轉(zhuǎn)錄一樣輕松。直接將提取的miRNA與反響緩沖液混合物，混合并置于PCR1小時即可獲miRNAs分子的cDNAcDNA產(chǎn)物可以直接使用HaiGene優(yōu)化的HGmiRNA熒光定量PCR試劑盒進(jìn)展定量檢測，原理如以以下圖。hsa-miR-215’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’hsa-miR-215’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’PAPAmiRNARTPrimer進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAn-3’3’-NVTTTTTTTTTTTTTTTGACCTGGAC-5’(miRNARTPrimer)hsa-miR-21dT(15)tag3’-ATCGAATAGTCTGACTACAACTTTTTTTTTTTTTTTGACCTGGAC-’5反轉(zhuǎn)錄所得第一鏈cDNA產(chǎn)物利用HGmiRNA熒光定量PCR試劑盒特異性的上下游引物，進(jìn)展SYBRGreen定量檢測3’-ATCGAATAGTCTGACTACAACTTTTTTTTTTTTTTTGACCTGGAC-’5miRNA反轉(zhuǎn)錄至第一鏈cDNA操作步驟：按以下組安排制反轉(zhuǎn)錄反響液*miRNA 0.01～0.1μg〔通常1~4μl〕4×OnestepmiRNARTSolution 5μl10×miRNARTPrimer 2μlRnaseFreeH2O Upto20μl*留意：使用總RNA0.1～2μgRNA反轉(zhuǎn)錄效果要差于使用純度較高的miRNA，不建議使用總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。在PCR儀上按以下條件進(jìn)展反轉(zhuǎn)錄反響:37°C 30~60min95°C 5min2～4倍體積的RnaseFreeTEBufferddH20將模板稀釋后，用于RealTimePCR檢測。HGmiRNAPCR試劑盒進(jìn)展定量檢測【HaiGene，Cat.No.:PXXXXX】HaiGene的HGmiRNA熒光定量PCR試劑盒，包含SYBRGreen定量試劑和特異性的上下游引物檢測對，每一HaiGene的HGmiRNA熒光定量PCR試劑盒共有一萬余種，試劑盒編號為PXXXXX，每一個miRNA分子對應(yīng)一個檢測試劑盒，可于HGmiRNAqPCRkit.xls中查詢。假設(shè)您爭論的miRNAPCR試劑盒，按下表進(jìn)展選擇。

HGmiRNAPCR試劑盒內(nèi)參名稱貨號適用物種RNU6BP01501哺乳動物RNU48P01502人RNU44P01503人SnoRNA135P01504鼠SnoRNA202P01505鼠〔〕其它miRNA熒光定量檢測試劑盒見HGmiRNAqPCRkit.xl?！?〕HaiGenemiRNA熒光定量PCR2020μl1μl。1配制反響體系A(chǔ)BA:需要添加ROX染料進(jìn)展反響孔間信號矯正的Real-TimePCR儀，包括：ABIPRISM7000/7700/7900HT，7300/7500/7500FastReal-TimePCR(AppliedBiosystems)；Mx3000P(Stratagene)20μlPCR反響體系：5×GoldenHSSYBRGreenqPCRMix 4μl 1×50×ROXReferenceDye 0.4μl 1×PCRForwardPrimer(20×) 1μl 1×PCRReversePrimer(20×) 1μl cDNA模板 1～2.5μlddHO Upto20μl2B:無需添加ROX染料進(jìn)展反響孔間信號矯正的Real-TimePCRLightCycler(RocheDiagnostics)；MiniOpticon、Opticon2MyiQ2CFX96Real-TimePCR(Bio-Rad&MJ)；Line-Gene(Bioer，杭州博日)20μlPCR反響體系：5×GoldenHSSYBRGreenqPCRMix 4μl 1×PCRForwardPrimer(20×) 1μl 1×PCRReversePrimer(20×) 1μl cDNA模板 1～2.5μlddHO Upto20μl23Real-TimePCR反響通常承受兩步法，程序如下：Stage1:95℃15minStage2:95℃5s60℃ 30s 30~40cyclesStage3: Dissociationanalysis反響完畢后確認(rèn)Real-TimePCR的cDNA樣品和NTC陰性比照的擴增曲線和融解曲線。英文文章材料與方法撰寫方法MaterialandMethodsformiRNAextractionandqPCRGoldenHSSYBRGreenqPCRMixunderthefollowingconditions:95°Cfor15min,35cyclesofThemiRNAwasextractedfromthetissueorcellsamplesusingmiRNAExtractionKit(HaiGene,Harbin,China)accordingtomanufacturer’sprotocol.ToinvestigatethemiR-21expressionlevelintissuesamples,cDNAsynthesiswascarriedoutaccordingtotheprotocolofOneStepmiRNAcDNASynthesisKit(HaiGene,Harbin,China),inwhichpoly(A)tailingofthemiRNAsisfollowedbyreversetranscriptionwithataggedpoly(T)primerdescribedbyBalcellsetal[2].Briefly,thereactionmix(20μl)consistingof100ngofmiRNA,5μ lof4×OnestepmiRNARTSolutionand2μlof10×miRNARTPrimerwasincubatedat37°Cfor1hourfollowedbyenzymeinactivationat95°Cfor5minutes.QuantificationofmiRNAwasperformedbyHGmiRNASYBRGreenPCRKit(HaiGene,Harbin,China).RealTimePCRwasperformedin20GoldenHSSYBRGreenqPCRMixunderthefollowingconditions:95°Cfor15min,35cyclesof95°Cfor5s,and60°Cfor30sinLightCycler480(Roche).MiR-21levelswerenormalizedtoU6BRNAlevelsusingthe2(-ΔCt)model.Real-timePCRassayswereperformedinduplicateforeachsample,andthemeanvaluewasusedforthecalculationofmiRNAexpressionlevels.ThestatisticalanalysesweredoneusingMicrosoftExcel(Microsoft)bothtocalculatetheSDandtotestforstatisticallysignificantdifferencesbetweenthesamplesusingaTtest.AvalueP<0.05wasconsideredstatisticallysignificant.參考文獻(xiàn)：miR-Q:anovelquantitativeRT-PCRapproachfortheexpressionprofilingofsmallRNAmoleculessuchasmiRNAsinacomplexsample.BMCMolBiol.2023.PMC2374797.SpecificandsensitivequantitativeRT-PCRofmiRNAswithDNAprimers.BMCBiotechnol.2023.PMC3135530.ReliablereferencemiRNAsforquantitativegeneexpressionanalysisofstressresponsesinCaenorhabditiselegans.BMCGenomics.2023.PMID:24656064.ProfilingmicroRNAsinlungtissuefrompigsinfectedwithActinobacilluspleuropneumoniae.BMCGenomics.2023.PMID:22953717.TheroleofviralandhostmicroRNAsintheAujeszky”sdiseasevirusduringtheinfectionprocess.PLoSOne.2023.PMID:24475202.MicroRNApolymorphismsandenvironmentalsmokeexposureasriskfactorsforoesophagealsquamouscellcarcinoma.PLoSOne.20