Cx43對(duì)大鼠急性水中毒后腦水腫的影響

Cx43對(duì)大鼠急性水中毒后腦水腫的影響

【摘要】目的:探討縫隙連接蛋白43(Cx43)對(duì)大鼠急性水中毒后腦水腫的影響.方法:術(shù)前2h于右腦室注射Cx43阻斷劑反義寡核苷酸,細(xì)胞胞體較肥大；生理鹽水對(duì)照組腦組織比重較ODNs處理組降低明顯.結(jié)論:阻斷Cx43可減輕大鼠急性水中毒后腦水腫的程度，Cx43可能參與了腦水腫的形成.

【關(guān)鍵詞】腦水腫星形膠質(zhì)細(xì)胞縫隙連接蛋白43

0引言

腦水腫是神經(jīng)科危重患者常見的一種病變,也是腦血管病、顱內(nèi)占位性病變、顱腦損傷和炎癥等過(guò)程的主要病理生理改變.超微結(jié)構(gòu)顯示,在腦水腫早期主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹,它可能是腦水腫發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要因素［1］.而對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上主要表達(dá)的Cx43是否參與腦水腫形成的研究很少.我們初步探討了Cx43與水中毒后腦水腫的相關(guān)性.

1材料和方法

材料健康清潔級(jí)SD大鼠48只，體質(zhì)量230～250g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；小鼠抗GFAP抗體、兔抗鼠IgG稀釋液、生物素卵白素過(guò)氧化物酶復(fù)合物ABC,DAB；溴苯；煤油(西安化學(xué)試劑廠)；反義寡核苷酸序列:5′ACTCCAGTCACCCAT3′(上海生工合成).

方法

實(shí)驗(yàn)分組將大鼠隨機(jī)分為Cx43阻斷劑預(yù)處理組和生理鹽水對(duì)照組.急性水中毒后兩組將存活大鼠按腦水腫后處死時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為20，30，60min3個(gè)亞組；每亞組8只，其中5只用做免疫組化，3只用于測(cè)腦組織比重.

動(dòng)物模型制作參照文獻(xiàn)［2-3］的方法制作大鼠急性水中毒后腦水腫模型，血腦屏障無(wú)受損，即向大鼠腹腔快速注射相當(dāng)于大鼠體質(zhì)量20％的蒸餾水和去氨基精加壓素.

側(cè)腦室注射Cx43阻斷劑反義寡核苷酸用生理鹽水稀釋至mmol/L,大鼠右側(cè)腦室為注射靶點(diǎn)(前囟向后mm,右側(cè)旁開中線mm,硬膜下mm),在腦水腫前2h用微量注射器緩慢注入2μL反義寡聚核苷酸或等體積生理鹽水.

組織制備以20mL/L戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，生理鹽水沖洗后灌注40g/L多聚甲醛500mL，取腦后浸入40g/L多聚甲醛，持續(xù)4～6h.置于2g/L蔗糖溶液至沉底，冰凍切片機(jī)冠狀位連續(xù)切片，片厚10μm，貼附于載玻片上.每鼠取5張切片行免疫組化染色.

免疫組織化學(xué)ABC法染色切片入PBS液充分漂洗后,入3mL/LTritonX100處理,依次孵育:小鼠抗GFAP(1∶3000)抗體稀釋液24h(4℃)；生物素標(biāo)記的兔抗鼠IgG(1∶500)稀釋液2h(室溫)；ABC復(fù)合物(1∶500)2h(室溫).每一步驟后均用PBS液漂洗3次,每次10min,最后DAB/H2O2溶液呈色20min(室溫).室溫常規(guī)裱片、脫水、透明、DPX封固、光鏡觀察.陰性對(duì)照用PBS替代一抗,其余步驟同上.光鏡觀察結(jié)果.

腦組織比重的測(cè)定參照文獻(xiàn)［4］的方法制作腦組織比重梯度柱測(cè)定腦水腫后腦組織比重的變化.用溴苯(比重)和煤油(比重)兩種有機(jī)溶液配制成備用液A(比重)和備用液B(比重).各取備用液A和B100mL引流至量筒內(nèi)，靜止30min，用微量注射器分別吸取由無(wú)水硫酸鈉配制的系列標(biāo)準(zhǔn)液(比重分別為,,,)滴入梯度柱，待下沉2min后立刻準(zhǔn)確讀取量筒上的刻度.以下沉刻度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)液比重為縱坐標(biāo)求出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程.梯度柱的測(cè)量范圍在～之間.6組動(dòng)物在水中毒后各時(shí)間點(diǎn)迅速斷頭取腦，在大腦皮層采取直徑mm,厚度為2mm的5個(gè)樣本.放入梯度柱內(nèi).待下沉2min時(shí)記錄下沉刻度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出腦組織比重.

圖像分析在免疫組化切片緊靠損傷區(qū)周邊皮質(zhì)區(qū)用熒光顯微鏡隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞，取均數(shù)作為此切片該區(qū)域的得數(shù)，并觀察細(xì)胞形態(tài).計(jì)數(shù)用ImageProPlus軟件，由病理醫(yī)師盲法執(zhí)行.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以x±s表示.多樣本間均數(shù)比較采用OneWayANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用Donnettt檢驗(yàn)，為差異有顯著性.

2結(jié)果

免疫組化染色急性水中毒后20min生理鹽水對(duì)照組和ODNs預(yù)處理組GFAP陽(yáng)性星形細(xì)胞腫脹不明顯；30min時(shí)細(xì)胞逐漸腫脹，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多；60min時(shí)細(xì)胞胞體明顯腫脹，細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯增多；但兩組大鼠在急性水中毒后各時(shí)間點(diǎn)二亞組間相比，生理鹽水對(duì)照組細(xì)胞腫脹明顯，胞體肥大深染，突起粗大；生理鹽水較對(duì)照組細(xì)胞個(gè)數(shù)增多明顯；兩組相比有顯著差異(，圖1，表1).

A～C：生理鹽水對(duì)照組急性水中毒后20,30,60min；D～F：ODNs預(yù)處理組急性水中毒后20,30,60min.標(biāo)尺=50μm.

圖1各時(shí)間點(diǎn)腦水腫生理鹽水對(duì)照組與ODNs預(yù)處理組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞DAB×20

表1各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與ODNs預(yù)處理組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

vs生理鹽水對(duì)照.

液體比重柱的穩(wěn)定性和梯度均勻性共制作了5個(gè)比重梯度柱，反映比重柱高度與比重直線相關(guān)性的指標(biāo)決定系數(shù)(coefficientofdetermination,r2)均≥表明制作的液體比重柱的穩(wěn)定性和梯度均勻性均較佳.

腦組織比重急性水中毒20，30，60min后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，兩組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)腦組織比重均逐漸降低，說(shuō)明腦組織含水量逐漸增多；但在急性水中毒后各時(shí)間點(diǎn)兩亞組比較，生理鹽水對(duì)照組腦組織比重較ODNs預(yù)治療組降低明顯.

表2各時(shí)間點(diǎn)腦水腫對(duì)照組與ODNs預(yù)處理組大鼠腦皮質(zhì)區(qū)組織比重

vs生理鹽水對(duì)照.

3討論

縫隙連接蛋白(connexins,Cx)是一個(gè)蛋白超家族,目前在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的Cx至少有20種［5］,在哺乳動(dòng)物腦內(nèi),星形膠質(zhì)細(xì)胞上主要表達(dá)Cx43.6個(gè)結(jié)構(gòu)相同的Cx在細(xì)胞膜上形成六聚體結(jié)構(gòu)構(gòu)成縫隙連接半通道［6］，相鄰兩個(gè)細(xì)胞各自胞膜上的縫隙連接半通道對(duì)接而成縫隙連接(GJ).星形膠質(zhì)細(xì)胞間及星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元、其它膠質(zhì)細(xì)胞間存在廣泛的GJ［7］，使細(xì)胞間進(jìn)行信息、能量和物質(zhì)的交換，參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等生理過(guò)程起著重要的調(diào)控作用.

星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的水通道蛋白4主要參與水的轉(zhuǎn)運(yùn)，在形態(tài)上已有文獻(xiàn)報(bào)道AQP4與Cx43形成的縫隙連接成正四面體分布［8-9］，提示Cx43與AQP4在功能上具有相關(guān)性,共同維持著滲透平衡.袁華等［10］報(bào)道星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境滲透壓的變化比神經(jīng)元敏感，并可能通過(guò)GJ主動(dòng)調(diào)節(jié)神經(jīng)元對(duì)滲透壓的反應(yīng).曹榮等［11］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)Cx43半通道參與細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié).在細(xì)胞毒性腦水腫中，Na+,Cl-大量?jī)?chǔ)存于細(xì)胞內(nèi),水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以恢復(fù)平衡,造成過(guò)量的Na+,K+和水在細(xì)胞內(nèi)積聚而致腦水腫，K+和水的平衡密切相關(guān)［11］.腦損傷后細(xì)胞外K+濃度明顯升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞攝入過(guò)多的K+可迅速通過(guò)GJ運(yùn)送到相鄰的細(xì)胞，加重腦水腫并使腦水腫范圍擴(kuò)大.

我們采用大鼠急性水中毒后腦水腫模型，觀察Cx43腦水腫相關(guān)性發(fā)現(xiàn)：生理鹽水對(duì)照組腦皮質(zhì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比ODNs預(yù)處理組細(xì)胞腫脹明顯，細(xì)胞增生數(shù)量較多；生理鹽水對(duì)照組腦皮質(zhì)區(qū)組織比重較ODNs預(yù)處理組降低明顯.說(shuō)明生理鹽水對(duì)照組大鼠腦水腫較ODNs預(yù)處理組明顯.實(shí)驗(yàn)通過(guò)減少Cx43表達(dá)，進(jìn)而減少了GJ的形成，阻止K+在細(xì)胞間的傳導(dǎo)，一定程度上減輕了腦水腫程度.推測(cè)Cx43可能參與腦水腫的病理形成過(guò)程.

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