基因組測序與序列組裝

第二講基因組測序與序列組裝當(dāng)前第1頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)主要內(nèi)容:什么是基因組什么是基因DNA測序的方法DNA序列的組裝人類基因組計(jì)劃水稻基因組計(jì)劃后基因組學(xué)當(dāng)前第2頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)1.什么是基因組

基因組就是一個(gè)物種中所有基因的整體組成。基因組有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系。當(dāng)前第3頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae12E.coli4.6GenomeSize(Mb)當(dāng)前第4頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)什么是C值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.

在真核生物中，C值一般隨著生物的進(jìn)化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。

C值悖理：生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加當(dāng)前第5頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)細(xì)菌真菌等動(dòng)物陰影部分為一個(gè)門內(nèi)C-值的范圍當(dāng)前第6頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)重復(fù)順序高度重復(fù)順序：長度：幾個(gè)——幾千個(gè)bp拷貝數(shù)：幾百個(gè)——上百萬個(gè)首尾相連，串聯(lián)排列集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等）也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)順序：一般分散于整個(gè)基因組中；長度和拷貝數(shù)差別很大單一順序：基因主要位于單一順序動(dòng)物中單一順序約占50％植物中單一順序約占20％當(dāng)前第7頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。

基因分類：編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等；編碼蛋白質(zhì)的基因2.什么是基因？當(dāng)前第8頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)基因的不連續(xù)性Intron和Exon:大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順序(Exon)都被或長或短的非編碼順序(Intron)隔開當(dāng)前第9頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)基因家族一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能,可以相互補(bǔ)償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6當(dāng)前第10頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)假基因(Pseudogene)來源于功能基因但已失去活性的DNA序列產(chǎn)生假基因的原因有:由重復(fù)產(chǎn)生的假基因;加工的假基因,由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺的基因(Truncatedgene)當(dāng)前第11頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)重疊基因:同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白的信息.

重迭基因有以下幾種情況：*一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部*部分重疊*兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對當(dāng)前第12頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)*一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部如：B和A，E和D其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同---ATG-----//------AATGCC----//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA當(dāng)前第13頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)*部分重疊如：K和C*兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對如：D和J-------TAATG-------D終止密碼子J起始密碼子當(dāng)前第14頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)3.DNA測序的方法鏈終止法測序化學(xué)降解法測序自動(dòng)化測序非常規(guī)DNA測序當(dāng)前第15頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)3.1鏈終止法測序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通過合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來讀取待測DNA分子的順序。當(dāng)前第16頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)技術(shù)路線與要求制備單鏈模板↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸

↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列

A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬粒克隆DNADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無5’→3′外切酶活性C無3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基當(dāng)前第17頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第18頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第19頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)3.2化學(xué)降解法測序基本原理:

在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán)，再用化合物處理，使DNA分子在被修飾的位置降解。當(dāng)前第20頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)技術(shù)路線

將雙鏈DNA樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記，以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理，獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳，讀取DNA的核苷酸順序當(dāng)前第21頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)

堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶當(dāng)前第22頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)化學(xué)法測序?qū)嵗哙ぎ?dāng)前第23頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)3.3自動(dòng)化測序基本原理與鏈終止法測序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基.當(dāng)前第24頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)當(dāng)前第25頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)3.4非常規(guī)測序毛細(xì)管電泳

用毛細(xì)管電泳取代聚丙烯凝膠平板電泳，節(jié)省時(shí)間，加快測序進(jìn)程，其他程序同鏈終止法或化學(xué)測序法。

當(dāng)前第26頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)DNA芯片測序基本原理將各種排列順序的寡核苷酸點(diǎn)播在芯片上,每個(gè)點(diǎn)播的寡核苷酸在排列的方陣中都有指定的位置.待檢測的DNA分子與芯片溫浴,凡是能雜交的寡核苷酸都會(huì)在確定位置發(fā)出信號(hào),然后根據(jù)獲取的信息將寡核苷酸的順序進(jìn)行對比組裝,拼接成完全的DNA順序.當(dāng)前第27頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)利用基因芯片進(jìn)行雜交測序的原理當(dāng)前第28頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)4序列的組裝4.1隨機(jī)測序與序列組裝

隨機(jī)測序也稱”鳥槍法”。序列組裝原理：直接從已測序的小片段中尋找彼此重疊的測序克隆，然后依次向兩側(cè)鄰接的序列延伸。優(yōu)點(diǎn):不需預(yù)先了解任何基因組的情況.ABCABCABCABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝當(dāng)前第29頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)ABC小片段測序計(jì)算機(jī)拼裝鳥槍法(Shotgun)測序的問題CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP錯(cuò)裝當(dāng)前第30頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)實(shí)例:流感嗜血桿菌基因組的測序及序列組裝超聲波打斷純化的基因組DNA↓瓊脂糖電泳收集1.6～2.0Kb的區(qū)段、純化

↓構(gòu)建到質(zhì)粒載體中↓隨機(jī)挑選19687個(gè)克隆,進(jìn)行28643次測序,得到可讀順序?yàn)?1631485bp↓組裝成140個(gè)覆蓋全基因組范圍的獨(dú)立的順序重疊群,↓當(dāng)前第31頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)

各重疊群間仍有間隙

順序間隙物理間隙

↓↓

載體或宿主菌選用不當(dāng)而被丟失的順序測序時(shí)遺漏的測序解決辦法:通過相鄰已知順序作為探針篩選已有的基因組文庫解決辦法:利用其它宿主菌與載體重新構(gòu)建文庫當(dāng)前第32頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)4.2限制測序

限制測序：是指將一段染色體區(qū)段的DNA序列進(jìn)行組裝.一些已繪制了遺傳圖與物理圖的微生物基因組測序中也采用這一方法.如高等植物擬南芥基因組的測序完全依據(jù)克隆重疊群，先進(jìn)行各個(gè)BAC克隆的隨機(jī)測序，再進(jìn)行序列組裝；

水稻基因組測序計(jì)劃采取的策略與此相同.當(dāng)前第33頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)4.3指導(dǎo)測序與序列組裝

建立在基因組圖譜基礎(chǔ)上的”鳥槍法”,即所謂”指導(dǎo)鳥槍法”或”指導(dǎo)測序”。在人類基因組進(jìn)入測序組裝階段就采用此方法，其基本步驟如下:A構(gòu)建平均為2Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序;B構(gòu)建平均10Kb的人類基因組質(zhì)粒文庫,進(jìn)行雙向測序,讀取2個(gè)端部順序;C參考人類基因組圖,特別是大量的STS位標(biāo)作為基點(diǎn),進(jìn)行序列組裝，排成重疊克隆群.當(dāng)前第34頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)先將染色體打成比較大的片段(幾十-幾百Kb),利用分子標(biāo)記將這些大片段排成重疊的克隆群(Contig),分別測序后拼裝.這種策略叫基于克隆群(contig-based)的策略.ABCABC大片段contig小片段測序拼裝當(dāng)前第35頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)兩種策略的比較鳥槍法策略

指導(dǎo)測序策略不需背景信息構(gòu)建克隆群(遺傳、物理圖譜)時(shí)間短需要幾年的時(shí)間需要大型計(jì)算機(jī)得到的是草圖(Draft)得到精細(xì)圖譜當(dāng)前第36頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)4.5其他測序路線重要區(qū)域優(yōu)先測序人們對感興趣的基因或與疾病相關(guān)的基因優(yōu)先測序.如:人類主要組織相容性復(fù)合區(qū)位于第6號(hào)染色體,與人類免疫系統(tǒng)有關(guān)，因而優(yōu)先測序.當(dāng)前第37頁\共有39頁\編于星期三\2點(diǎn)EST(Expressed