【氨基酸紙色譜層析法實驗研究5600字（論文）】

氨基酸紙色譜層析法實驗研究目錄摘要 1Abstract 21引言 42氨基酸常見分析方法 42.1紙色譜和薄層色譜分析 42.2氣相色譜分析 52.3高效液相色譜分析 53材料與方法 63.1材料 63.2試劑 63.3顯色方式 64實驗步驟 64.1點樣方式與展開劑的優(yōu)化 64.2固定相的優(yōu)化 74.3顯色方式的優(yōu)化 75結(jié)果與分析 75.1點樣方式優(yōu)化結(jié)果分析 75.2固定相優(yōu)化及展開劑優(yōu)化結(jié)果分析 85.3顯色方式優(yōu)化結(jié)果分析 86結(jié)語 11參考文獻(xiàn) 111引言紙色譜法指的是將濾紙當(dāng)做支撐物的層析科技，由于濾紙中的纖維中有很多的親水性輕基，所以和水能夠相融合，但和有機溶劑有比較弱的親和力，因此進(jìn)行展層的過程中，水為固定相，流動相為有機溶劑，因溶質(zhì)在二相中具有不相同的分配系數(shù)，各氨基酸通過流動相運動的速率也不一樣，那么把以上的氨基酸分離出來，以此產(chǎn)生距離原點長度不同的色譜點，不同物質(zhì)分配系數(shù)之間的差異大，就可以輕易將其分離開來。將樣品分離之后所在紙色譜的具體方位，一般通過比移值Rf(即原點到色譜點中心的距離和原點到溶劑前沿距離的比值)來體現(xiàn)，倘若色譜紙質(zhì)量、溫度和展開劑的構(gòu)成等沒有變化，那么該物質(zhì)的Rf就是個固定值，能夠被當(dāng)做定性分析的參照。紙色譜分離的相關(guān)技術(shù)被普遍使用在色素、蛋白質(zhì)、中草藥、氨基酸與染料等的鑒定與分離中，其具有樣品用量少、操作簡易的優(yōu)勢，不僅能夠在實驗室中進(jìn)行定性分離，還能在工業(yè)生產(chǎn)過程中對產(chǎn)品進(jìn)行分析制備，目前已經(jīng)是生物工程與生物化學(xué)等領(lǐng)域無法或缺的一種分析手段。在《食品生物化學(xué)》的課程里，氨基酸紙色譜為學(xué)生最為關(guān)鍵的實驗實訓(xùn)內(nèi)容，然而倘若根據(jù)課程中的流程進(jìn)行操作，一是需要的時間很長，不能通過四個學(xué)時完成整個實驗；二，通過毛細(xì)管或者微量注射器來展開點樣的模式被人為因素所嚴(yán)重制約，不同組之間獲取的結(jié)果有顯著的差異；三是濾紙很容易被污染，將濾紙當(dāng)做惰性支持物對最終的分離效果具有一定的影響；四展開劑的速率很慢同時具有刺激性的味道；五通過噴霧器對顯色劑進(jìn)行操作，其均勻性與噴出量都不能精準(zhǔn)掌握，極易對學(xué)生實訓(xùn)服造成污染。為了將實驗方式進(jìn)行優(yōu)化，本篇文章將主要改善氨基酸紙色譜實驗的點樣模式、固定相、顯色方式與展開劑。2氨基酸常見分析方法2.1紙色譜和薄層色譜分析通過紙色譜法來研究氨基酸在上世紀(jì)四五十年代逐漸興起，因這種方式分離效能高、操作簡單同時設(shè)備低廉等優(yōu)勢，所以在那個時候被業(yè)界大量使用。紙色譜法根據(jù)各個檢測用顯色劑與層析液，能夠分析三十種以上的氨基酸和相關(guān)衍生物。薄層色譜(TLC)，其另一個稱呼為薄層層析，是一種固液吸附色譜。薄層色譜是在上個世紀(jì)六十年代逐步興起的分析模式。此模式具有靈敏度高、操作簡單、設(shè)備簡單的特點，被大量使用在檢測與分離氨基酸領(lǐng)域，能分離分析六十種以上的氨基酸與相關(guān)衍生物。與紙層析相比，薄層層析的分辨率通常要高出十倍至一百倍，不僅可以對幾十微克的樣品進(jìn)行分離，還可以在分離制備多于500mg的樣品中使用。為更好的展開定量分析還能夠采用濃鹽酸和濃硫酸這種腐蝕性的顯色劑進(jìn)行顯色。所以，與紙色譜相比，薄層色譜分析的使用范圍更廣。由于氨基酸分析的探討逐步擴大與普及再加上分析儀器的迅速研發(fā)，還有為了符合不同樣品對分析時間短、靈敏度高與重復(fù)性較好的相關(guān)需求，通過薄層色譜與紙色譜來對氨基酸進(jìn)行分析的選擇不斷減少。2.2氣相色譜分析上世紀(jì)五六十年代，由于氣相色譜的興起和廣泛使用，在氨基酸的分析中氣相色譜法逐步成為主流。因為氣象相色譜法具有操作簡單、效能高、應(yīng)用廣泛、選擇性好的突出優(yōu)勢，同時還容易和質(zhì)譜共同應(yīng)用，來對氨基酸的結(jié)構(gòu)進(jìn)行明確，以期可以發(fā)現(xiàn)新氨基酸。這些年以來，氨基酸分析技術(shù)已經(jīng)被普遍使用在了食品、生化和醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而氨基酸轉(zhuǎn)化成氣體非常困難，想要通過氣相色譜來對氨基酸進(jìn)行分析就需要先把氨基酸轉(zhuǎn)換成容易被氣化的延生物質(zhì)，再通過適宜的檢測器與柱子來展開分離檢測。借助氣相色譜GC來對衍生氨基酸進(jìn)行檢測已經(jīng)經(jīng)歷了很長的時間演變，現(xiàn)在較為合理的氣相色譜衍生方式就是把氨基酸衍生成特丁基二甲硅烷基、N-七氟丁酞基異丁酷衍生物、N-三氟乙酞基正丁酷。Husek推廣了通過氣相色譜來對氯甲酸乙酷衍生的氨基酸進(jìn)行檢測的方式，從樣品的衍生直至分離檢測可以在五分鐘內(nèi)實現(xiàn)。GC/MS是比較強的氨基酸分析的一類方式，特別是在研究氨基酸的對映異構(gòu)體包含了突出的作用。盡管氣相色譜的毛細(xì)管柱就有較好的靈敏度與分析成效，但因為氣相色譜衍生氨基酸的條件非常嚴(yán)苛并且專一性較差，此外，還因其他分析儀器的演變，因此使得氣相色譜沒有被廣泛使用在氨基酸的分析檢測領(lǐng)域。2.3高效液相色譜分析從上世紀(jì)八十年代開始，借助高效液相色譜(HPLC)來對氨基酸進(jìn)行檢測的研究逐步快速發(fā)展起來，尤其是這二十年間通過柱前衍生的高效液相色譜法是迅速興起的分離分析技術(shù)之一。高效液相色譜和不同氨基酸衍生方式進(jìn)行有機融合的分析科技興起的速度很快，同時慢慢體現(xiàn)了其突出的優(yōu)勢，即準(zhǔn)確性好、使用范圍廣、速度快、分析時間短、靈敏度高等；使得氨基酸分析的前景變得更加廣闊了。HPLC需把氨基酸于柱前變換成適宜反相色譜分離，同時還可以被充分測定的衍生物。柱前衍生的重點就是對衍生試劑的篩選，對衍生試劑進(jìn)行篩選的標(biāo)準(zhǔn)為可以和不同氨基酸進(jìn)行定量反應(yīng)，一類氨基酸僅可以產(chǎn)生出一類化合物同時該物質(zhì)還要有相應(yīng)的穩(wěn)定性，沒有形成或者極易消除干擾物；分析時間短、操作簡單、靈敏度高、色譜分離分辨率高且容易達(dá)成自動化、讓形成的化合物可以在各高效液相色譜儀中被檢測。氨基酸的柱前衍生HPLC技術(shù)用自身突出的優(yōu)越性即重復(fù)性好、靈敏度高與分析時間短等，得到了業(yè)界的青睞。在實踐操作過程中，到底選用哪一種方式需要通過分析速度、簡便程度、衍生速度、測定二級氨基酸和膚氨酸能力、重復(fù)性、干擾因素、靈敏度等進(jìn)行篩選。3材料與方法3.1材料層析缸(燒杯500mL)、剪刀、色譜濾紙(新華一號濾紙)、培養(yǎng)皿、薄層板、吹風(fēng)機、毛細(xì)管或微量注射器5uL、移液槍5uL、封口膜噴霧器、攝子、尺子、鉛筆。3.2試劑(1)0.5%的氨基酸溶液(擷氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸)，不同試劑都是分析純。(2）展開劑(即100mL)。1號：V正丁醇/V冰醋酸為4：1；2號：V正丁醇/V冰醋酸/V乙醇/V水為4：1：1：2；3號：V正丁醇/V甲酸/V水為15：3：2；4號：V95%乙醇/V水=7：3。3.3顯色方式傳統(tǒng)方式為展開后通過噴霧器均勻噴灑0.1%茚三酮溶液來顯色；改良的方式為在100mg茚三酮添加預(yù)先準(zhǔn)備的展開劑。4實驗步驟4.1點樣方式與展開劑的優(yōu)化（1）濾紙。選擇一張濾紙，規(guī)格為22X14cm。(2)點樣。在一端2厘米的地方借助鉛筆進(jìn)行劃線，再在線上依次采取0.5%的亮氨酸、0.5%脯氨酸、谷氨酸0.5%、擷氨酸0.5%進(jìn)行均衡點樣(毛細(xì)管、微量注射器與移液槍各5uI,)，往復(fù)三次，每一次點樣結(jié)束為通過吹風(fēng)機中的冷風(fēng)將其吹干處理，每一點擴散直徑小于5mm。把點樣完成的濾紙最終卷成筒狀，通過大頭針進(jìn)行縫合，需要依據(jù)課本中的流程用針線縫，不然會將濾紙損壞，對實驗的最終結(jié)果造成影響。(3)展開。在培養(yǎng)皿中加入20mL的展開劑，將培養(yǎng)皿放在500mL的燒杯里，同時把點樣筒直立在培養(yǎng)皿里，保持點樣端在下面，通過封口膜將燒杯口封緊實，當(dāng)溶液升高到15至18cm的情況下，將濾紙取出，再用鉛筆將溶劑前沿界線畫出，然后用吹風(fēng)機調(diào)到冷風(fēng)檔吹干。(4)顯色。借助噴霧器均勻噴上0.1個百分點的茚三酮溶液(前面章節(jié)中的展開劑1、2、3的茚三酮用正丁醇為溶劑，展開劑4中的茚三酮是用乙醇為溶劑)，迅速用熱風(fēng)吹干，就能夠顯現(xiàn)不同方位與顏色的斑點。(5)計算Rf值。原點至色譜點中心的距離/原點至溶劑前沿的距離=Rf。4.2固定相的優(yōu)化（1）薄層板。選擇一張薄層板(為22X14cm)。(2)點樣。依據(jù)2.1改善的最好點樣法來展開。(3)展開和顯色。將1cm的展開層置于500mL的燒杯中，借助攝子把點樣完成的薄層板置于燒杯中，點樣端放在下面，通過封口膜將燒杯口封緊實，當(dāng)溶液升高到15至18cm的情況下，將薄層板取出。剩下的流程和上述4.1相同。4.3顯色方式的優(yōu)化（1）薄層板、濾紙準(zhǔn)備與點樣法根據(jù)4.1、4.2優(yōu)化的流程進(jìn)行。（2）展開和顯色。展開劑是100mg茚三酮和4種展開劑混合，把點樣筒、板置于展開劑，通過封口膜將燒杯口封緊實，當(dāng)溶液升高到15至18cm時，將濾紙取出，通過鉛筆對溶劑前沿進(jìn)行標(biāo)記，用熱風(fēng)將其吹干。就可以顯現(xiàn)出不同方位與顏色的斑點，借助鉛筆將斑點輪廓描出。再應(yīng)用Rf值公式將不同樣品的Rf值推導(dǎo)出來。5結(jié)果與分析5.1點樣方式優(yōu)化結(jié)果分析通過毛細(xì)管、微量注射器、移液槍依次進(jìn)行點樣，然后根據(jù)傳統(tǒng)方式展開分離，濾紙是固定相，顯色為0.1%水合茚三酮正丁醇溶液，流動相為V正丁醇/V冰醋酸=4：1，毛細(xì)管與微量注射器很容易將濾紙扯爛同時點樣圈不夠均勻，操作上比較難，移液槍點樣5uL量在操作上比較簡單，同時點樣圈相同，所以選擇移液槍來點樣。5.2固定相優(yōu)化及展開劑優(yōu)化結(jié)果分析將薄層板與濾紙作為固定相載體，流動相為四類不同展開劑，來分離四個類別的氨基酸，兩類固定相和四類展開劑都可以實現(xiàn)較好的分離成效，實驗結(jié)果請見表1與表2。從表格1所示可以發(fā)現(xiàn)，與濾紙相比，薄層板層析分離的成效更好。Rf值描述的是在支持物上溶質(zhì)移動的速度，對R：值造成影響的因素不少，有物質(zhì)的極性與結(jié)構(gòu)、層析所用溶劑、支持物、pH、展開方式、樣品溶液中雜質(zhì)、溫度，對氨基酸展開分離檢測時，與紙色譜層析法進(jìn)行比較，薄層色譜層析法優(yōu)勢主要包括顯色靈敏、速度快與斑點集中等。四個類別的展開劑都可以實現(xiàn)分離的目標(biāo)。和試劑毒性、分離成效與時間相融合，3號展開劑即V正丁醇：V甲酸：V水=15：3：2具有非常好的分離效果同時毒性低、所用時間短；展開劑4中的乙醇很容易揮發(fā)掉，讓展開劑濃度不夠精確，時間長，同時展開劑要隨用隨配也使得實驗預(yù)備工作比較繁復(fù)，所以不適合使用。所以，將薄層板作為固定相，流動相為3號展開劑，借助移液槍來點樣獲取的分離成效最好。5.3顯色方式優(yōu)化結(jié)果分析將薄層板作為固定相，借助移液槍來點樣，將100mg茚三酮混合4類展開劑作為展開劑，來分離4個類別的氨基酸，相關(guān)結(jié)果請見表格3。從表格3所可以發(fā)現(xiàn)，借助100mg茚三酮混合展開劑3作為流動相，將其當(dāng)做新展開劑來展開分離工作，所用時間較短，顯色靈敏、成效明顯，試驗時間充分減少。通過以上闡述，把茚三酮添加以V正丁醇：V甲酸：V水=15：3：2的展開劑里作為流動相，固定相為薄層板，用移液槍進(jìn)行點樣，在實驗時不用和有毒試劑進(jìn)行接觸，還大大縮減了實驗時間，獲取的結(jié)果比較顯著，實現(xiàn)了預(yù)期目標(biāo)。表1濾紙層析實驗結(jié)果方法項目所用時間（min）XYRf文獻(xiàn)值濾紙展開劑1亮氨酸11.5200.580.5787脯氨酸4.5200.260.16谷氨酸5.4200.270.35擷氨酸7.5200.380.32展開劑2亮氨酸12200.600.5780脯氨酸4.5200.230.16谷氨酸5.2200.260.35擷氨酸7.5200.380.32展開劑3亮氨酸11200.550.5790脯氨酸4.5200.230.16谷氨酸5.5200.280.35擷氨酸7.6200.380.32展開劑4亮氨酸12200.600.5792脯氨酸4.6200.230.16谷氨酸5.6200.280.35擷氨酸7.3200.370.32表2薄層色譜層析實驗結(jié)果方法項目所用時間（min）XYRf文獻(xiàn)值薄層板展開劑1亮氨酸8.6200.430.5780脯氨酸3.1200.160.16谷氨酸3.9200.200.35擷氨酸6.2200.300.32展開劑2亮氨酸8.2200.410.5772脯氨酸2.5200.130.16谷氨酸3.4200.170.35擷氨酸6200.300.32展開劑3亮氨酸8200.400.5785脯氨酸2.8200.140.16谷氨酸4200.200.35擷氨酸6.2200.310.32展開劑4亮氨酸8.2200.410.5787脯氨酸2.6200.130.16谷氨酸3.8200.190.35擷氨酸6.4200.320.32表3薄層色譜層析優(yōu)化結(jié)果方法項目所用時間（min）XYRf文獻(xiàn)值薄層板展開劑1亮氨酸8.6200.430.5751脯氨酸3.1200.160.16谷氨酸3.9200.200.35擷氨酸6.2200.310.32展開劑2亮氨酸8.2200.410.5748脯氨酸2.5200.130.16谷氨酸3.4200.170.35擷氨酸6200.300.32展開劑3亮氨酸8200.400.5752脯氨酸2.8200.140.16谷氨酸4200.200.35擷氨酸6.2200.310.32展開劑4亮氨酸8.2200.410.5756脯氨酸2.6200.130.16谷氨酸3.8200.190.35擷氨酸6.4200.320.326結(jié)語因氨基酸分析對于食品科學(xué)、生命科學(xué)和醫(yī)藥學(xué)等方面而言具有舉足輕重的作用，所以，對氨基酸分析法進(jìn)行探討和創(chuàng)新會得到越來越多人的關(guān)注?，F(xiàn)在全世界已經(jīng)探討分析過的氨基酸分析法主要有紙色譜、氣相色譜法、茚三酮比色法、高效液相色譜法、薄層色譜法、高效陰離子交換色譜等方式。比較完善的具有代表性的氨基酸分析法之一就是柱后茚三酮衍生高效陽離子交換色譜法，這個方式在以后的發(fā)展趨勢為圍繞著儀器的柱系統(tǒng)和自動化領(lǐng)域而展開。柱前衍生反相高效液相色譜法是目前探討分析較為普遍的氨基酸分析法之一，這種方法以后的發(fā)展方向為篩選出靈敏度高以及穩(wěn)定性高的衍生試劑，讓此方式越來越可靠、靈敏。全新的氨基酸分析法為無需柱前后衍生的高效陰離子交換色譜—積分脈沖安培測試法，這個方式也較為靈敏、簡便，在未來的氨基酸分析法中會獲取長遠(yuǎn)的發(fā)展，可靠的積分脈沖安培檢測器的開發(fā)與新型高效陰離子交換柱再加上分析、測試機理的探討分析，會是這個方式在以后研究的核心。CE未來的趨勢依舊是進(jìn)一步提升速度、分辨率與檢測器的選擇性，把質(zhì)譜儀和CE進(jìn)行充分的融合，能夠極為快速、精確的分析生物分子特點，用來深入