淮海工學院生物化學大實驗報告niujun10800字

淮海工學院生物化學大實驗報告niujun10800字

海洋學院綜合大實驗報告專業(yè)：生物技術班級生技121班姓名：newjhon學號：21題目：生物化學大實驗指導教師：孫玉英學年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特異性及溫度、pH對酶活性的影響班級：生技121姓名：牛軍學號：20121211111【摘要】本實驗采用控制變量法分別研究唾液淀粉酶的特異性以及溫度、pH對該酶活性的影響，得出結論：唾液淀粉酶對淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8時，酶的作用效果分別是最好的?！娟P鍵詞】唾液淀粉酶，溫度，pH，特異性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一種水解酶，具有水解可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。本實驗通過比較在不同條件下唾液淀粉酶對淀粉水解后的顯色反應顏色的不同，進而了解不同溫度、pH對唾液淀粉酶活性的影響以及該酶的特異性。2材料及方法2.1材料主要材料為人的唾液以及淀粉溶液2.1.1試劑蒸餾水NaCl（分析純，中國上海試劑一廠），可溶性淀粉（化學純，廣州醫(yī)藥站化學試劑公司），蔗糖（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），CuSO4（分析純，上海試一化學試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，中國上海試劑一廠），無水Na2CO3（分析純，南京化學試劑一廠），KI（化學純，南京化學試劑有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠），濃HCl（分析純，南京化學試劑有限公司），NaOH。2.1.2配制試劑①唾液淀粉酶的制備：用燒杯取蒸餾水或自來水，含于口中，1—2分鐘后，吐入50mL燒杯中，備用。②Benedict試劑A、取CuSO417.3g溶于100mL熱蒸餾水中，冷后稀釋至150mL；B、取檸檬酸鈉173g及無水Na2CO3100g，加水600mL加熱使之溶解，冷后稀釋至850mL；1C、將A液緩慢注入B液中，混勻備用。（可長期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M檸檬酸鈉38.8mL，然后用濃HCl調至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M檸檬酸鈉18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M檸檬酸鈉2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH調至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：稱取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于燒杯中，加入200mL水，于電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直至液體澄清。待冷卻后轉移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。稱取碘化鉀3g溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加I1g，振蕩溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3儀器試管（10支）移液管（7支）大燒杯（1000ml）HW·YS型電子恒溫水?。?7℃）石棉網洗耳球玻璃棒膠頭滴管，小燒杯（50，100ml）BP221S型電子天平pH試紙，容量瓶試管架2.2實驗方法2.2.1酶的特異性（1）取兩支試管編號①、②，①號加入0.5%的淀粉液2mL,②號加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）與兩支試管各加入制備好的唾液1mL；（3）將兩支試管同時放入37℃恒溫水浴鍋中保溫；（4）15分鐘后，取出兩試管，各加入Benedict試劑1mL；（5）將兩試管同時放入沸水中煮沸6分鐘；（6）取兩支試管，觀察記錄顏色的變化，并注意是否有紅棕色產生。A型50Hz220V—800W雙層鐵皮電爐2表1酶的特異性驗證2.2.2溫度對酶活性的影響①取三支試管并編號①、②、③，同時加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混勻；②將管①、管②、管③同時分別放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分鐘后，取出各管，分別加入碘液數滴，觀察并記錄各管顏色變化。表2溫度對酶活性的影響2.2.3pH對酶活性的影響①取試管3支編號6、7、8，按下表加入試劑；②3支試管同時放入37℃恒溫水浴鍋內保溫；③15分鐘后，取出3支試管，分別加入碘試劑數滴，每加一滴，注意搖勻，觀察并記錄顏色變化。表3pH對酶活性的影響33結果與分析3．1實驗結果3.1.1酶的特異性實驗現(xiàn)象：①號試管經沸水浴后，試管內顏色仍為藍色，但在試管底部可以看出有些許磚紅色沉淀出現(xiàn)；②號試管經沸水浴后顏色沒有發(fā)生變化(仍為淺藍色。（如圖1）②號試管①號試管圖1酶的特異性實驗現(xiàn)象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。說明唾液淀粉酶具有特異性。3.1.2溫度對酶活性的影響實驗現(xiàn)象：①號試管加5滴碘液并混勻后顏色趨近與碘液原來的顏色，但較②號試管顏色較深；②號試管加5滴碘液并混勻后也趨近碘液本身顏色，但比碘液顏色淺；③號試管加5滴碘液并混勻后變成深藍紫色。（如圖2）。①②③圖2溫度對酶活性的影響實驗現(xiàn)象表明：經過冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能將淀粉分解成葡萄糖；而在37℃條件下唾液淀粉酶活性較高，將淀粉分解成葡萄糖。說明低溫對唾液淀粉酶活性有一定影響。經過沸水浴后，唾液淀粉酶變性，不能分解淀粉。3.1.3pH對酶活性的影響實驗現(xiàn)象：①號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成酒紅色；②號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后接近碘液本身的顏色；③號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成淺藍黃色。（如圖3）。4①②③圖3pH對酶活性的影響實驗現(xiàn)象表明：pH為1.5（強酸性）條件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH為6.8（接近中性）條件下，唾液淀粉酶活性較高，能水解淀粉；pH為9.8（堿性）條件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是較pH1.5和pH9.8相比，酶的活性較弱。3.2結果分析本實驗研究酶的特異性及溫度、pH對酶活性的影響得到以下結果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，驗證了酶的特異性，與理論相符。在溫度對酶活性影響實驗中，由顏色變化可以得出結論：高溫降低酶活性，低溫對酶活有較小的抑制作用。在pH對酶活性影響實驗中，得出的結論是：高pH對酶活抑制較大，低pH對酶活抑制較小。4討論從實驗中可以得出結論：唾液淀粉酶具有高度特異性，其活性受溫度、pH值等多種因素影響。但本組實驗所得磚紅色沉淀較少，有些實驗組沒有沉淀產生，導致實驗與預期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明顯的個體差異，因而為了確定恰當的唾液稀釋倍數和反應時間，建議在原實驗項目之前增加唾液稀釋倍數確定實驗。唾液淀粉酶活性存在明顯的性別差異[1]和個體差異，不同個體的酶活性相差達到上百倍，其主要是由于編碼該酶的基因在體內的拷貝數差異所決定的[2-3]在進行該實驗操作過程中會發(fā)現(xiàn)不同同學的唾液淀粉酶活力不同，在實驗過程中所用的唾液的稀釋倍數也不同。本實驗探究溫度對酶活性影響的結論與預期實驗結果有差異，且發(fā)現(xiàn)有實驗證明酶的活性在沸水浴(95℃)中并沒有受到影響，反而比恒溫水浴(37℃)反應的更徹底[4]；本實驗探究溫度對酶活性影響的結論與預期實驗結果不一，需要改進實驗方案：不要檢測反應物(淀粉)，用斐林試劑檢測產物(還原糖)進行判斷，且注意斐林試劑的用量為5%HCl用量的2倍[5]。因此，要進一步探究溫度、pH對酶活性的影響，確定酶的最適溫度和最適pH，需要更加嚴格周密的實驗方案。55參考文獻[1]歸改霞.性別不同對唾液淀粉酶活性影響的研究.衛(wèi)生職業(yè)2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]馬彥玲.不同溫度影響唾液淀粉酶活性實驗操作流程的再改進.河南職工醫(yī)學院學報,2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影響淀粉酶活性的探究.生物學通報,2008,43(10):49-506血紅蛋白凝膠過濾層析班級：生技121【摘要】本實驗利用SephadexG－25制備凝膠柱，通過凝膠過濾層析的方法，從新鮮雞血中制備雞的血紅蛋白，經洗脫液不斷洗脫最終收集到含有雞血紅蛋白的樣液?！娟P鍵詞】凝膠過濾層析，血紅蛋白,分離純化1前言分離和提純蛋白質方法多種多樣，其中最為重要的兩種方法就是電泳和層析，在這些方法中主要是利用蛋白質之間各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質、溶解度、吸附性質和對其他分子的生物學親和力[1]。凝膠過濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質的層析方法，又稱分子排阻層析、分子篩層析等,它是利用某些化學惰性的多孔網狀結構的物質(凝膠)為填料,通過洗脫液的連續(xù)洗脫,使混合物中的各種物質按其分子體積大小和形狀的差異而得到分離,已廣泛應用于大分子物質的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測定等方面[2]。凝膠過濾層析具有設備簡單、操作方便、分離迅速和不影響樣品生物活性等優(yōu)點,但凝膠過濾層析對蛋白混合物的最佳分離效果受許多因素的影響。通過本實驗的學習，了解凝膠柱層析的原理及應用，掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好基礎。2材料與方法2.1材料2.1.1實驗材料新鮮雞血Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠）；NaH2PO4·2H2O（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；蒸餾水；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）（分析純，江蘇徐州試劑二廠）；SephadexG－25；固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕；檸檬酸鈉（分析純，中國上海試劑一廠）2.1.3配置試劑7姓名：牛軍學號：201212111112.1.2藥品①磷酸緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：稱取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：稱取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。①凝血：添加抗凝劑（150g/LEDTA.k2）的新鮮雞血2.1.4儀器BP221S型電子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝膠溶脹[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸餾水充分溶脹。待凝膠溶脹平衡后，用傾瀉法除去細小顆粒，再加入與凝膠等體積的pH7.0磷酸緩沖液，在真空干燥器中減壓除氣（過夜），準備裝柱。2.2.2裝柱將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時開啟螺旋夾，控制一定流速。裝柱后形成的凝膠床長約20cm，使膠床表面保持2-3cm液層。2.2.3平衡繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。2.2.4樣品制備（1）取1mL雞的抗凝血放入小燒杯中，加5mLpH7.0的磷酸緩沖液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固體，用玻棒攪動使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小燒杯中混勻。2.2.5上樣旋開層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時，立即加入0.4mL上述混合液，待其進入膠床表面僅留約lmm液層時，加入0.5mL緩沖液，再當膠床表面僅留約lmm液層時，吸取0.5mL血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央。慢慢打開螺旋夾，待大部分8層析柱（Φ1cm×20cm）燒杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）膠頭滴管樣品進入膠床、床面上僅有l(wèi)mm液層時，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進入膠床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脫緩沖液。2.2.6洗脫繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。等有紅色液體滴出時開始收集液體，直至滴出液體顏色變淺。2.2.7凝膠的回收。實驗完畢用洗脫液把柱內有色物質洗脫干凈，保留凝膠柱重復使用。3結果與分析3.1實驗結果凝膠經溶脹、裝柱、沉降后形成膠床，用磷酸緩沖液平衡后，沿層析柱內壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其進入膠后往膠床面中央加入雞血血紅蛋白，等其進入膠床后加入磷酸緩沖液。血紅蛋白在膠床中緩慢層析，分為三層：上層呈現(xiàn)黃色，是鐵氰化鉀；中層呈現(xiàn)暗紅色，是雞血中的小分子物質及少量血紅蛋白；最下層呈現(xiàn)鮮紅色。收集層析柱中的紅色的液體部分即為血紅蛋白。本次實驗收集的血紅蛋白的量大約2mL。3.2結果分析本次實驗中，層析的樣品在膠床內分三層，符合理論；在實驗過程中，樣品洗脫速度較為合適，流速基本控制在每分鐘6滴，洗脫獲得的血紅蛋白較其他實驗組顏色略淺，總體而言，本實驗是比較成功的，但在一些方面仍需要改進：成功之處：①層析速度控制準確，樣品的條帶清晰，分層清楚；②層析過程中操作規(guī)范，加樣準確，層析結果較好。不足之處：①配制FeSO4溶液時，由于操作不及時，導致FeSO4被氧化，進而重新配制；9②有血紅蛋白層析出時未能及時收集，導致部分血紅蛋白損失。③層析后的柱子污染較為嚴重，抗凝血在層析前能離心處理下最好。④實驗后，沒有保持柱子處于緩沖體系中，出現(xiàn)柱子變干的情況。4討論凝膠層析主要根據被測樣品分子量的差異,在固定相上受到阻滯程度不同而達到分離的目的。分子量大的物質隨流動相移動速度較快,先流出層析床。反之,分子量小的物質移動速度較慢,后流出[4]。凝膠過濾層析的操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，葡聚糖凝膠的吸附力弱，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果，也可用于去除高分子物質（如核酸、蛋白質、多糖等）中的一些小分子雜質。測定已知分子量的物質通過凝膠過濾層析洗脫體積，再測定未知分子量的大分子物質體積，從而測定高分子物質的分子量。鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡單,保持樣品的生物活性等優(yōu)點,這種方法已廣泛應用于大分子物質的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測定。5參考文獻[1]史偉，禹婷.蛋白質的層析分離內蒙古農業(yè)科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周呂,丁濂,等.現(xiàn)代醫(yī)學實驗技巧全書[M].北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1995[3]王璞,林紅,朱濱.凝膠過濾層析實驗中Sephadex的溶脹與回收保存.中國科技論文統(tǒng)計源期刊,2006,23(2):24-25[4]楊歌德,姜玉梅,周宏博.凝膠過濾層析分離蛋白質實驗中三種過濾介質分離效果的比較.哈爾濱醫(yī)科大學學報,2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳—蛋白質分子量的測定班級：生技121【摘要】本實驗利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定凝膠過濾分離的雞血血紅蛋白的分子量。通過電泳后的條帶計算樣品遷移率，對比標準標準蛋白曲線，估算血紅蛋白分子量?！娟P鍵詞】SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，血紅蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種用作測定蛋白質分子量常用的生物化學實驗方法。它的基本原理是SDS與蛋白質分子結合,形成復合物。而且各種蛋白-SDS復合物在凝膠電泳中的遷移率只與蛋白質的分子量有關系。用這種方法測定蛋白質的分子量,操作簡便,快速,所需設備廉價,所得結果在分子量為15kD-200kD的范圍內,與用其他方法測得的分子量相比,誤差一般在正負10%以內[1]:聚丙烯酰胺凝膠是網狀結構,具有分子篩效應,可以根據蛋白質分子大小的不同而分離蛋白質。電泳時,分子量小的蛋白質跑得快在下面,而分子量大的蛋白質跑得慢在上面SDS在蛋白質研究領域有著重要作用。2材料與方法2.1材料雞血血紅蛋白2.1.1試劑SDS（十二烷基硫酸鈉）（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）N,N’甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）Tris（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）甘氨酸（Gly）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）NaH2PO4（分析純，天津市福晨化學試劑廠）Na2HPO4（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠）考馬斯亮藍R—250（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）50%甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）冰乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）蒸餾水過硫酸銨（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）HCl（分析純，南京化學試劑有限公司）巰基乙醇（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）甘油（分析純，宜興市鈕家化學試劑廠）溴酚藍（分析純，上?；瘜W試劑總廠）11姓名：牛軍學號：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）2.1.2配置試劑①10%過硫酸銨：稱取1.002g過硫酸銨固體粉用蒸餾水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容。②凝膠注液：稱取Acr29g，Bis1g于燒杯中，然后加蒸餾水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉搖勻。③樣品溶解液：SDS4.02g，巰基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚蘭0.01g，pH7.2磷酸緩沖液2mL。加蒸餾水溶解，轉移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉搖勻。④4X濃縮膠buffer：稱取Tris6.0153g,用HCl調pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分離膠buffer：稱取Tris36.3598g,用80mL蒸餾水溶解，再用濃HCl調pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸餾水至200mL。⑥電泳buffer：稱取Tris12.1875g，Gly57.748g和檸檬酸4.0149g,放入到500mL大燒杯中，加蒸餾水60℃水浴溶解，轉移至2000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，混勻后在pH計上調至pH7.2。⑧染色液：稱取0.25g考馬斯亮藍R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于燒杯中，轉移至500mL容量瓶中。⑨脫色液：75mL冰乙酸，875mL蒸餾水與50mL甲醇混合。2.1.3儀器DYC2-24D型垂直板型電泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量進樣器（50μL）；培養(yǎng)皿（直徑120mm）；電吹風；DYY-2C型直流穩(wěn)壓電泳儀；燒杯（25mL、50mL、100mL）；細長滴管；手術刀片；電爐。122.2方法2.2.1安裝垂直板電泳槽、凝膠制備先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個電極槽中間夾有一個凝膠模，該模由1個U形硅膠框、長與短的玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。通過U形膠帶將兩塊玻璃板封好，由此便形成一個“夾心”凝膠腔，再將封好的玻璃板插入電泳槽。注意操作過程中勿用手接觸灌膠的玻璃面。為了檢驗裝好的電泳槽是否漏膠，可以先加少量水檢驗封好的玻璃板是否會漏膠，確定不漏后將水倒出，并用吸水紙吸干凝膠腔中的水分。按照表1所示制備凝膠表1凝膠制備方法用吸管吸取分離膠，沿壁緩緩注入已準備好的膠室中，膠液加到離膠室頂部1.5厘米處。注膠后應立即覆蓋3-5毫米的水層，垂直靜止聚合30分鐘左右。聚合后將覆蓋的水層倒出，并吸干。2.2.2加樣一般每個凹形樣品槽內，只加一個種樣品或已知分子量的混合標準蛋白質，將樣品與已知分子量的標準蛋白加在同一塊凝膠上，加樣體積要根據凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，本實驗加樣體積為20μL。如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加樣時，將微量注射器的針頭通過電極緩沖液伸入加樣槽內，盡量接近底部，輕輕推動微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。2.2.3電泳加樣后，將電極緩沖液分別倒入上下電泳槽，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負極，下槽接正極。打開電源，先將電流調至25mA，10min候，將電流調至75mA，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊1-1.5cm處停止電泳，關閉電源，一般電泳過程需5-6h。2.2.4染色[3]與脫色13電泳結束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用解剖刀撬開短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標志，將凝膠從玻璃板上取下，放入大的培養(yǎng)皿中染色30～60min，用蒸餾水漂洗數次，然后放入脫色液中脫色。勤換脫色液，12小時后可清晰地辨認出蛋白質區(qū)帶，48小時后可脫至背景無色。若蛋白質區(qū)帶清晰，可將電泳圖譜照相保存。2.3Mr的計算通常以相對遷移率Mr來表示遷移率，相對遷移率的計算方法如下：用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及銅絲與凝膠頂端的距離，按下式計算：相對遷移率Mr＝樣品遷移距離（cm）染料遷移距離（cm）以標準蛋白質Mr的對數對相對遷移以標準蛋白質Mr的對數對相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據待測樣品的相對遷移率，從標準曲線上查出其Mr。3結果與分析3.1實驗結果點樣時，從右往左的順序依次：①，②，③（前三組為本組實驗條帶）；④，⑤（為溫奇秦組）⑥為Marker。很明顯，marker帶沒有跑出，各組的蛋白條帶也沒有跑出.樣品遷移率沒法計算，所以蛋白的分子量無法計算。3.2結果分析本組制備的血紅蛋白樣液沒有跑出條帶，標準蛋白marker及其他組血紅蛋白樣液均沒有跑出條帶，說明蛋白樣液的制備沒有問題。縱觀整個實驗流程，本次實驗沒有成功的原因可能有以下幾點：①Temed藥品作用效果不明顯，加大劑量后對蛋白電泳產生了影響②由于Temed在低pH值時失效，會使聚合作用延遲，所以可能是分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液的pH偏低14③由于濃縮膠凝固太慢，煮好的標準蛋白marker沒有即時使用，過夜后再次進行沸水煮，很大可能使標準蛋白失效，依此推斷，樣品蛋白也失效。④凝膠中存在SDS,SDS的存在干擾了考馬斯亮藍與蛋白質的結合，雖然甲醇可以破壞SDS，但可能是樣品溶解液中SDS過多導致染色失敗。4討論聚丙烯酰胺凝膠已成為目前生化實驗最常用的支持介質［2］，通過使用強陰離子SDS建立的SDS技術已成為蛋白質分離、分析的常用方法［3－4］在用SDS凝膠電泳測定蛋白質分子量時應注意：要保證蛋白質-SDS復合物達到1.4gSDS/g蛋白質的比率并具有相同構像；要根據所測蛋白質分子量的范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇蛋白質分子量范圍與性質與待測樣品相近的蛋白質作標準蛋白質；在凝膠電泳中，影響遷移率的隱私較多，而在制膠和電泳過程中，很難每次都將各項條件控制的完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測定蛋白質分子量，每次測定樣品必須同時做標準曲線，而不得利用另一次電泳的標準曲線；不是所有的蛋白質都能用SDS-凝膠電泳法測定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質用這種方法測出的分子量是不可靠的。因此，這一方法需要我們不斷探索創(chuàng)新，從而對其改良[5]，以發(fā)揮其優(yōu)越性，避免其不良方面。5參考文獻[1]張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實驗方法和技術北京:高等教育出版社,1987.86.[2]郭曉君．蛋白質電泳實驗技術［M］．北京:科學出版社，1999．［3]范培昌．生物大分子印漬術和應用［M］．上海:上?？茖W技術文獻出版社，1989:106－107．［4]陳亞飛，孫宇．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛇毒抗瘤蛋白的相對分子質量［J］．中國生化藥物，2004，25(5):300－303．[5]葉長春.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進湖北工業(yè)大學學報,2009,24(4):16-1815

＋淮海工學院生物化學大實驗報告niujun發(fā)表于：2023.1.23來自：字數：10877手機看范文海洋學院綜合大實驗報告專業(yè)：生物技術班級生技121班姓名：newjhon學號：21題目：生物化學大實驗指導教師：孫玉英學年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特異性及溫度、pH對酶活性的影響班級：生技121姓名：牛軍學號：20121211111【摘要】本實驗采用控制變量法分別研究唾液淀粉酶的特異性以及溫度、pH對該酶活性的影響，得出結論：唾液淀粉酶對淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8時，酶的作用效果分別是最好的?！娟P鍵詞】唾液淀粉酶，溫度，pH，特異性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一種水解酶，具有水解可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。本實驗通過比較在不同條件下唾液淀粉酶對淀粉水解后的顯色反應顏色的不同，進而了解不同溫度、pH對唾液淀粉酶活性的影響以及該酶的特異性。2材料及方法2.1材料主要材料為人的唾液以及淀粉溶液2.1.1試劑蒸餾水NaCl（分析純，中國上海試劑一廠），可溶性淀粉（化學純，廣州醫(yī)藥站化學試劑公司），蔗糖（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），CuSO4（分析純，上海試一化學試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，中國上海試劑一廠），無水Na2CO3（分析純，南京化學試劑一廠），KI（化學純，南京化學試劑有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠），濃HCl（分析純，南京化學試劑有限公司），NaOH。2.1.2配制試劑①唾液淀粉酶的制備：用燒杯取蒸餾水或自來水，含于口中，1—2分鐘后，吐入50mL燒杯中，備用。②Benedict試劑A、取CuSO417.3g溶于100mL熱蒸餾水中，冷后稀釋至150mL；B、取檸檬酸鈉173g及無水Na2CO3100g，加水600mL加熱使之溶解，冷后稀釋至850mL；1C、將A液緩慢注入B液中，混勻備用。（可長期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M檸檬酸鈉38.8mL，然后用濃HCl調至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M檸檬酸鈉18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M檸檬酸鈉2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH調至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：稱取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于燒杯中，加入200mL水，于電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直至液體澄清。待冷卻后轉移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。稱取碘化鉀3g溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加I1g，振蕩溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3儀器試管（10支）移液管（7支）大燒杯（1000ml）HW·YS型電子恒溫水?。?7℃）石棉網洗耳球玻璃棒膠頭滴管，小燒杯（50，100ml）BP221S型電子天平pH試紙，容量瓶試管架2.2實驗方法2.2.1酶的特異性（1）取兩支試管編號①、②，①號加入0.5%的淀粉液2mL,②號加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）與兩支試管各加入制備好的唾液1mL；（3）將兩支試管同時放入37℃恒溫水浴鍋中保溫；（4）15分鐘后，取出兩試管，各加入Benedict試劑1mL；（5）將兩試管同時放入沸水中煮沸6分鐘；（6）取兩支試管，觀察記錄顏色的變化，并注意是否有紅棕色產生。A型50Hz220V—800W雙層鐵皮電爐2表1酶的特異性驗證2.2.2溫度對酶活性的影響①取三支試管并編號①、②、③，同時加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混勻；②將管①、管②、管③同時分別放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分鐘后，取出各管，分別加入碘液數滴，觀察并記錄各管顏色變化。表2溫度對酶活性的影響2.2.3pH對酶活性的影響①取試管3支編號6、7、8，按下表加入試劑；②3支試管同時放入37℃恒溫水浴鍋內保溫；③15分鐘后，取出3支試管，分別加入碘試劑數滴，每加一滴，注意搖勻，觀察并記錄顏色變化。表3pH對酶活性的影響33結果與分析3．1實驗結果3.1.1酶的特異性實驗現(xiàn)象：①號試管經沸水浴后，試管內顏色仍為藍色，但在試管底部可以看出有些許磚紅色沉淀出現(xiàn)；②號試管經沸水浴后顏色沒有發(fā)生變化(仍為淺藍色。（如圖1）②號試管①號試管圖1酶的特異性實驗現(xiàn)象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。說明唾液淀粉酶具有特異性。3.1.2溫度對酶活性的影響實驗現(xiàn)象：①號試管加5滴碘液并混勻后顏色趨近與碘液原來的顏色，但較②號試管顏色較深；②號試管加5滴碘液并混勻后也趨近碘液本身顏色，但比碘液顏色淺；③號試管加5滴碘液并混勻后變成深藍紫色。（如圖2）。①②③圖2溫度對酶活性的影響實驗現(xiàn)象表明：經過冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能將淀粉分解成葡萄糖；而在37℃條件下唾液淀粉酶活性較高，將淀粉分解成葡萄糖。說明低溫對唾液淀粉酶活性有一定影響。經過沸水浴后，唾液淀粉酶變性，不能分解淀粉。3.1.3pH對酶活性的影響實驗現(xiàn)象：①號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成酒紅色；②號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后接近碘液本身的顏色；③號試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成淺藍黃色。（如圖3）。4①②③圖3pH對酶活性的影響實驗現(xiàn)象表明：pH為1.5（強酸性）條件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH為6.8（接近中性）條件下，唾液淀粉酶活性較高，能水解淀粉；pH為9.8（堿性）條件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是較pH1.5和pH9.8相比，酶的活性較弱。3.2結果分析本實驗研究酶的特異性及溫度、pH對酶活性的影響得到以下結果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，驗證了酶的特異性，與理論相符。在溫度對酶活性影響實驗中，由顏色變化可以得出結論：高溫降低酶活性，低溫對酶活有較小的抑制作用。在pH對酶活性影響實驗中，得出的結論是：高pH對酶活抑制較大，低pH對酶活抑制較小。4討論從實驗中可以得出結論：唾液淀粉酶具有高度特異性，其活性受溫度、pH值等多種因素影響。但本組實驗所得磚紅色沉淀較少，有些實驗組沒有沉淀產生，導致實驗與預期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明顯的個體差異，因而為了確定恰當的唾液稀釋倍數和反應時間，建議在原實驗項目之前增加唾液稀釋倍數確定實驗。唾液淀粉酶活性存在明顯的性別差異[1]和個體差異，不同個體的酶活性相差達到上百倍，其主要是由于編碼該酶的基因在體內的拷貝數差異所決定的[2-3]在進行該實驗操作過程中會發(fā)現(xiàn)不同同學的唾液淀粉酶活力不同，在實驗過程中所用的唾液的稀釋倍數也不同。本實驗探究溫度對酶活性影響的結論與預期實驗結果有差異，且發(fā)現(xiàn)有實驗證明酶的活性在沸水浴(95℃)中并沒有受到影響，反而比恒溫水浴(37℃)反應的更徹底[4]；本實驗探究溫度對酶活性影響的結論與預期實驗結果不一，需要改進實驗方案：不要檢測反應物(淀粉)，用斐林試劑檢測產物(還原糖)進行判斷，且注意斐林試劑的用量為5%HCl用量的2倍[5]。因此，要進一步探究溫度、pH對酶活性的影響，確定酶的最適溫度和最適pH，需要更加嚴格周密的實驗方案。55參考文獻[1]歸改霞.性別不同對唾液淀粉酶活性影響的研究.衛(wèi)生職業(yè)2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]馬彥玲.不同溫度影響唾液淀粉酶活性實驗操作流程的再改進.河南職工醫(yī)學院學報,2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影響淀粉酶活性的探究.生物學通報,2008,43(10):49-506血紅蛋白凝膠過濾層析班級：生技121【摘要】本實驗利用SephadexG－25制備凝膠柱，通過凝膠過濾層析的方法，從新鮮雞血中制備雞的血紅蛋白，經洗脫液不斷洗脫最終收集到含有雞血紅蛋白的樣液?！娟P鍵詞】凝膠過濾層析，血紅蛋白,分離純化1前言分離和提純蛋白質方法多種多樣，其中最為重要的兩種方法就是電泳和層析，在這些方法中主要是利用蛋白質之間各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質、溶解度、吸附性質和對其他分子的生物學親和力[1]。凝膠過濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質的層析方法，又稱分子排阻層析、分子篩層析等,它是利用某些化學惰性的多孔網狀結構的物質(凝膠)為填料,通過洗脫液的連續(xù)洗脫,使混合物中的各種物質按其分子體積大小和形狀的差異而得到分離,已廣泛應用于大分子物質的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測定等方面[2]。凝膠過濾層析具有設備簡單、操作方便、分離迅速和不影響樣品生物活性等優(yōu)點,但凝膠過濾層析對蛋白混合物的最佳分離效果受許多因素的影響。通過本實驗的學習，了解凝膠柱層析的原理及應用，掌握凝膠柱層析的基本操作技術，為進一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好基礎。2材料與方法2.1材料2.1.1實驗材料新鮮雞血Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠）；NaH2PO4·2H2O（分析純，天津市福晨化學試劑廠）；蒸餾水；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）（分析純，江蘇徐州試劑二廠）；SephadexG－25；固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕；檸檬酸鈉（分析純，中國上海試劑一廠）2.1.3配置試劑7姓名：牛軍學號：201212111112.1.2藥品①磷酸緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：稱取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：稱取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。①凝血：添加抗凝劑（150g/LEDTA.k2）的新鮮雞血2.1.4儀器BP221S型電子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝膠溶脹[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸餾水充分溶脹。待凝膠溶脹平衡后，用傾瀉法除去細小顆粒，再加入與凝膠等體積的pH7.0磷酸緩沖液，在真空干燥器中減壓除氣（過夜），準備裝柱。2.2.2裝柱將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時開啟螺旋夾，控制一定流速。裝柱后形成的凝膠床長約20cm，使膠床表面保持2-3cm液層。2.2.3平衡繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。2.2.4樣品制備（1）取1mL雞的抗凝血放入小燒杯中，加5mLpH7.0的磷酸緩沖液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固體，用玻棒攪動使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小燒杯中混勻。2.2.5上樣旋開層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時，立即加入0.4mL上述混合液，待其進入膠床表面僅留約lmm液層時，加入0.5mL緩沖液，再當膠床表面僅留約lmm液層時，吸取0.5mL血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央。慢慢打開螺旋夾，待大部分8層析柱（Φ1cm×20cm）燒杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）膠頭滴管樣品進入膠床、床面上僅有l(wèi)mm液層時，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進入膠床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脫緩沖液。2.2.6洗脫繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。等有紅色液體滴出時開始收集液體，直至滴出液體顏色變淺。2.2.7凝膠的回收。實驗完畢用洗脫液把柱內有色物質洗脫干凈，保留凝膠柱重復使用。3結果與分析3.1實驗結果凝膠經溶脹、裝柱、沉降后形成膠床，用磷酸緩沖液平衡后，沿層析柱內壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其進入膠后往膠床面中央加入雞血血紅蛋白，等其進入膠床后加入磷酸緩沖液。血紅蛋白在膠床中緩慢層析，分為三層：上層呈現(xiàn)黃色，是鐵氰化鉀；中層呈現(xiàn)暗紅色，是雞血中的小分子物質及少量血紅蛋白；最下層呈現(xiàn)鮮紅色。收集層析柱中的紅色的液體部分即為血紅蛋白。本次實驗收集的血紅蛋白的量大約2mL。3.2結果分析本次實驗中，層析的樣品在膠床內分三層，符合理論；在實驗過程中，樣品洗脫速度較為合適，流速基本控制在每分鐘6滴，洗脫獲得的血紅蛋白較其他實驗組顏色略淺，總體而言，本實驗是比較成功的，但在一些方面仍需要改進：成功之處：①層析速度控制準確，樣品的條帶清晰，分層清楚；②層析過程中操作規(guī)范，加樣準確，層析結果較好。不足之處：①配制FeSO4溶液時，由于操作不及時，導致FeSO4被氧化，進而重新配制；9②有血紅蛋白層析出時未能及時收集，導致部分血紅蛋白損失。③層析后的柱子污染較為嚴重，抗凝血在層析前能離心處理下最好。④實驗后，沒有保持柱子處于緩沖體系中，出現(xiàn)柱子變干的情況。4討論凝膠層析主要根據被測樣品分子量的差異,在固定相上受到阻滯程度不同而達到分離的目的。分子量大的物質隨流動相移動速度較快,先流出層析床。反之,分子量小的物質移動速度較慢,后流出[4]。凝膠過濾層析的操作條件比較溫和，可在相當廣的溫度范圍下進行，葡聚糖凝膠的吸附力弱，不需要有機溶劑，并且對分離成分理化性質的保持有獨到之處。對于高分子物質有很好的分離效果，也可用于去除高分子物質（如核酸、蛋白質、多糖等）中的一些小分子雜質。測定已知分子量的物質通過凝膠過濾層析洗脫體積，再測定未知分子量的大分子物質體積，從而測定高分子物質的分子量。鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡單,保持樣品的生物活性等優(yōu)點,這種方法已廣泛應用于大分子物質的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測定。5參考文獻[1]史偉，禹婷.蛋白質的層析分離內蒙古農業(yè)科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周呂,丁濂,等.現(xiàn)代醫(yī)學實驗技巧全書[M].北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社,1995[3]王璞,林紅,朱濱.凝膠過濾層析實驗中Sephadex的溶脹與回收保存.中國科技論文統(tǒng)計源期刊,2006,23(2):24-25[4]楊歌德,姜玉梅,周宏博.凝膠過濾層析分離蛋白質實驗中三種過濾介質分離效果的比較.哈爾濱醫(yī)科大學學報,2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳—蛋白質分子量的測定班級：生技121【摘要】本實驗利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定凝膠過濾分離的雞血血紅蛋白的分子量。通過電泳后的條帶計算樣品遷移率，對比標準標準蛋白曲線，估算血紅蛋白分子量。【關鍵詞】SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，血紅蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種用作測定蛋白質分子量常用的生物化學實驗方法。它的基本原理是SDS與蛋白質分子結合,形成復合物。而且各種蛋白-SDS復合物在凝膠電泳中的遷移率只與蛋白質的分子量有關系。用這種方法測定蛋白質的分子量,操作簡便,快速,所需設備廉價,所得結果在分子量為15kD-200kD的范圍內,與用其他方法測得的分子量相比,誤差一般在正負10%以內[1]:聚丙烯酰胺凝膠是網狀結構,具有分子篩效應,可以根據蛋白質分子大小的不同而分離蛋白質。電泳時,分子量小的蛋白質跑得快在下面,而分子量大的蛋白質跑得慢在上面SDS在蛋白質研究領域有著重要作用。2材料與方法2.1材料雞血血紅蛋白2.1.1試劑SDS（十二烷基硫酸鈉）（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）N,N’甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）Tris（化學純，北京拜爾迪生物技術有限公司）甘氨酸（Gly）（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）NaH2PO4（分析純，天津市福晨化學試劑廠）Na2HPO4（分析純，江蘇省連云港市化學試劑廠）考馬斯亮藍R—250（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）50%甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）冰乙酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）蒸餾水過硫酸銨（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）HCl（分析純，南京化學試劑有限公司）巰基乙醇（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）甘油（分析純，宜興市鈕家化學試劑廠）溴酚藍（分析純，上海化學試劑總廠）11姓名：牛軍學號：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化學純，國藥集團化學試劑有限公司）2.1.2配置試劑①10%過硫酸銨：稱取1.002g過硫酸銨固體粉用蒸餾水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容。②凝膠注液：稱取Acr29g，Bis1g于燒杯中，然后加蒸餾水溶解，轉移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉搖勻。③樣品溶解液：SDS4.02g，巰基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚蘭0.01g，pH7.2磷酸緩沖液2mL。加蒸餾水溶解，轉移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉搖勻。④4X濃縮膠buffer：稱取Tris6.0153g,用HCl調pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分離膠buffer：稱取Tris36.3598g,用80mL蒸餾水溶解，再用濃HCl調pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸餾水至200mL。⑥電泳buffer：稱取Tris12.1875g，Gly57.748g和檸檬酸4.0149g,放入到500mL大燒杯中，加蒸餾水60℃水浴溶解，轉移至2000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，混勻后在pH計上調至pH7.2。⑧染色液：稱取0.25g考馬斯亮藍R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于燒杯中，轉移至500mL容量瓶中。⑨脫色液：75mL冰乙酸，875mL蒸餾水與50mL甲醇混合。2.1.3儀器DYC2-24D型垂直板型電泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量進樣器（50μL）；培養(yǎng)皿（直徑120mm）；電吹風；DYY-2C型直流穩(wěn)壓電泳儀；燒杯（25mL、50mL、100mL）；細長滴管；手術刀片；電爐。122.2方法2.2.1安裝垂直板電泳槽、凝膠制備先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。這種電泳槽兩側為有機玻璃制成的電極槽，兩個電