蛋白質(zhì)的離子交換層析技術(shù)研究進(jìn)展

蛋白質(zhì)離子交換層析技術(shù)離子交換層析原理離子交換劑實(shí)驗(yàn)條件的確定具體操作方法常見(jiàn)問(wèn)題及處理12345應(yīng)用實(shí)例6當(dāng)前第1頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)1.離子交換層析的原理以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。蛋白質(zhì)（以靜電引力為主）的離子交換層析兩性分子，不同pH，所帶電荷種類和數(shù)目不同高級(jí)結(jié)構(gòu)，大分子，多位點(diǎn)吸附除靜電力還有氫鍵、疏水作用、范德華力等當(dāng)前第2頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)待分離的目標(biāo)分子和雜質(zhì)一起進(jìn)入平衡后的離子交換劑，目標(biāo)分子和雜質(zhì)因帶電量不同，與離子交換劑有不同的結(jié)合程度，通過(guò)逐漸增加鹽離子濃度，將目標(biāo)分子和雜質(zhì)分別洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子和雜質(zhì)的分離。當(dāng)前第3頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.離子交換劑基本結(jié)構(gòu)2.1指標(biāo)2.2分類2.3當(dāng)前第4頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.1離子交換劑的基本結(jié)構(gòu)基質(zhì)應(yīng)具備的特點(diǎn)：機(jī)械穩(wěn)定性強(qiáng)，適合高流速化學(xué)穩(wěn)定性好，在很寬的pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，能耐去污劑、有機(jī)溶劑。球形，顆粒均勻。親水性。高交換容量，要有較大的孔徑。水不溶性基質(zhì)活性基團(tuán)平衡離子++平衡離子當(dāng)前第5頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.2離子交換劑的指標(biāo)交換容量：離子交換劑能結(jié)合溶液中可交換離子的能力，通常用有效交換容量和實(shí)際交換容量來(lái)表示。膨脹度：干態(tài)的交換劑吸水后造成體積膨脹的程度。粒徑：一般都在3-300μm交聯(lián)度及網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)：交聯(lián)度越高，機(jī)械強(qiáng)度越好，耐壓性能越好。電荷密度：基質(zhì)顆粒單位表面積的取代基數(shù)量。對(duì)于蛋白質(zhì)，介質(zhì)的電荷密度往往較低。以免結(jié)合過(guò)牢，難以洗脫且易變性。粒徑↓→分辨率↑，分離效果↑，但流速↓實(shí)際交換容量指每克干介質(zhì)或每毫升濕膠包含的帶電功能基團(tuán)的數(shù)量有效交換容量指每克干介質(zhì)或每毫升濕膠在一定的實(shí)驗(yàn)條件下吸附某物質(zhì)的實(shí)際容量當(dāng)前第6頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類根據(jù)活性基團(tuán)的酸堿性質(zhì)和解離性質(zhì)：酸堿性質(zhì)：解離性質(zhì)：陽(yáng)離子交換劑：活性基團(tuán)為酸性，結(jié)合陽(yáng)離子陰離子交換劑：活性基團(tuán)為堿性，結(jié)合陰離子強(qiáng)離子交換劑：活性基團(tuán)為強(qiáng)酸強(qiáng)堿弱離子交換劑：活性基團(tuán)為弱酸弱堿類型名稱英文符號(hào)陰離子強(qiáng)堿季銨基Q季銨基乙基QAE弱堿二乙氨基乙基DEAE陽(yáng)離子強(qiáng)酸磺丙基SP磺乙基SE弱酸羧甲基CM蛋白質(zhì)分離純化時(shí)，條件必須溫和，通常用弱離子交換劑當(dāng)前第7頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類由于樹(shù)脂的孔徑過(guò)小，且電荷密度過(guò)高，疏水性過(guò)強(qiáng)使得大分子結(jié)合過(guò)牢而不易洗脫，同時(shí)，會(huì)造成變性。通常用于蛋白質(zhì)的離子交換劑多為纖維素等多糖類。纖維素葡聚糖瓊脂糖多糖類高效型非孔型聚乙烯醇型其它當(dāng)前第8頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類開(kāi)放性長(zhǎng)鏈，較大的表面積，吸附容量最大離子基團(tuán)少，排列稀疏，與蛋白質(zhì)結(jié)合不太牢固，易于洗脫良好的穩(wěn)定性，洗脫劑的選擇范圍廣纖維素當(dāng)前第9頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類目前使用交聯(lián)葡聚糖主要來(lái)自Pharmacia公司，主要有4種類型，都是以SephadexG為骨架商品名分別為SephadexA-25SephadexC-25SephadexA-50SephadexC-50SephadexA-25以SephadexG，即交聯(lián)葡聚糖為骨架A:陰離子C:陽(yáng)離子凝膠吸水值的10倍25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水2.5克葡聚糖當(dāng)前第10頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類123TECHNOSepharose系列SepharoseCL-6BBio-Gel系列34μm90μm200μm90μm粒徑大孔珠狀顆粒狀Q型SP型SepharoseHP弱型（DEAE，ANXCM）強(qiáng)型（Q，SP）SepharoseFFQ型SP型SepharoseBBDE型CM型瓊脂糖當(dāng)前第11頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列剛性的骨架結(jié)構(gòu)：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的結(jié)合都發(fā)生在顆粒表面液膜擴(kuò)散小，快速；顆粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，富含羥基，高度親水其它當(dāng)前第12頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)無(wú)孔型有孔型無(wú)孔型微孔型大孔型無(wú)孔型，交換發(fā)生在表面；有孔型，需進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)部再發(fā)生交換當(dāng)前第13頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)2.3離子交換劑的分類高效型：SOURCE系列、MonoBeads系列剛性的骨架結(jié)構(gòu)：高硬度、高流速親水表面：低特異性吸附非孔型：MiniBeads系列所有的結(jié)合都發(fā)生在顆粒表面液膜擴(kuò)散小，快速；顆粒小，分辨率高聚乙烯醇型：Toyopearl系列多孔型三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，富含羥基，高度親水其它當(dāng)前第14頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)3.實(shí)驗(yàn)條件的確定離子交換劑3.1色譜柱3.2緩沖液3.3當(dāng)前第15頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)3.1離子交換劑按規(guī)模：分析型分離，一般用柱色譜；大規(guī)模工業(yè)化分離，有柱色譜、膨脹床吸附、分批分離等多種模式按目的：在預(yù)處理和初分級(jí)階段，目的是提取和濃縮目標(biāo)分子；在細(xì)分級(jí)和最后的精制階段，目的是去除雜質(zhì)，獲得單一組分。目標(biāo)分子的大?。哼x擇合適孔徑的基質(zhì)目標(biāo)分子的電荷及pH穩(wěn)定性：在起始緩沖液中，目標(biāo)分子和介質(zhì)的功能基團(tuán)帶相反的電荷，以利于目標(biāo)分子結(jié)合在色譜柱上，起始相洗脫，雜質(zhì)和介質(zhì)的功能基團(tuán)帶相反的電荷，從而吸附在色譜柱上。這時(shí)，收集流穿峰即可。當(dāng)前第16頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)3.2色譜柱通常用高徑比較小的柱子離子交換柱的高度一般在5-20cm確定基本參數(shù)后，可通過(guò)直徑↑→擴(kuò)大分離規(guī)模。當(dāng)前第17頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)3.3緩沖液緩沖離子：與功能基團(tuán)帶相同的電荷pH：蛋白質(zhì)的pI→緩沖液的pH→緩沖液的種類

離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度↑→利于洗脫，不利于吸附當(dāng)前第18頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.離子交換的操作方法預(yù)處理4.1裝柱、平衡4.2上樣、洗滌4.3洗脫4.4色譜柱的再生4.5當(dāng)前第19頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.1預(yù)處理預(yù)裝柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列

無(wú)需處理，直接使用。濕膠：無(wú)需預(yù)處理，使用前傾去上清，添加起始緩沖液，攪勻后裝柱即可干膠：需溶脹。通常室溫1-2d，沸水浴2h。Sephadex系列：不能用蒸餾水，避免強(qiáng)烈攪拌。纖維素系列：①制造的過(guò)程中，產(chǎn)生一些細(xì)顆粒，將纖維素在水中攪勻后，自然沉降，傾去上清漂浮物，反復(fù)數(shù)次即可。②制造完后，未經(jīng)處理，含很多雜質(zhì)成分，需洗滌，用0.5mol/L的NaOH和0.5mol/L的HCl進(jìn)行“堿-酸-堿”反復(fù)浸泡，每次半小時(shí)，期間用蒸餾水洗至中性。當(dāng)前第20頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.2裝柱、平衡裝柱：排空柱底部的死體積，輕輕攪勻交換劑與緩沖液的混合液，玻棒引流，使液體沿柱壁流下，盡可能一次性注入，讓介質(zhì)自然沉降。保持柱的垂直狀態(tài)，防止產(chǎn)生氣泡、防止分層。平衡：用起始緩沖液平衡，檢測(cè)下端流出液與起始緩沖液在pH、電導(dǎo)、離子強(qiáng)度方面是否達(dá)一致。對(duì)于弱離子交換劑，本身具有一定的緩沖能力，平衡時(shí)間很長(zhǎng)。通常用酸或堿將pH調(diào)至起始pH；或用與起始緩沖液pH相同，但離子強(qiáng)度更大的緩沖液，加快pH平衡，最后用起始緩沖液平衡。當(dāng)前第21頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.3上樣、洗滌上樣加樣量：目的物含量為有效交換容量的10-20%。方法：預(yù)裝柱，通過(guò)恒流泵加樣。自裝柱，采用排干法：加樣時(shí)，不能攪動(dòng)床面，要保持床面的完整。洗滌加樣完后，用起始緩沖液填滿柱上端，擰緊上口，用恒流泵泵入起始緩沖液當(dāng)前第22頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.4洗脫緩沖離子：與功能基團(tuán)帶相同的電荷pH：蛋白質(zhì)的pI→緩沖液的pH→緩沖液的種類離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度↑→利于洗脫，不利于吸附當(dāng)前第23頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.4洗脫-般采用分部洗脫和連續(xù)洗脫。分部洗脫：幾種不同洗脫能力的緩沖液相繼進(jìn)行洗脫優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備和操作簡(jiǎn)單；洗脫迅速；洗脫液體積小缺點(diǎn)：性質(zhì)相近的組分不易分開(kāi)；同一組分出現(xiàn)多個(gè)峰連續(xù)洗脫：逐漸增強(qiáng)洗脫緩沖液的洗脫能力，分辨率↑梯度混合器當(dāng)前第24頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)4.5色譜柱的再生與清洗一般，高濃度鹽（通常是2M的NaCl）溶液清洗對(duì)于一些結(jié)合較牢固的物質(zhì)，如變性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些膠狀物，用酸和堿洗脫疏水性更強(qiáng)的蛋白、脂蛋白以及脂類，用非離子去污劑或有機(jī)溶劑（70%的乙醇或30%異丙醇）逆向清洗。瓊脂糖：鹽和0.5M的NaOH纖維素：鹽和0.1M的NaOH葡聚糖：避免在pH小于3的環(huán)境，可用1M的NaAC0.5M的NaOH交替清洗。當(dāng)前第25頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)5.常見(jiàn)問(wèn)題及處理層析速度太慢5.1蛋白質(zhì)不與樹(shù)脂結(jié)合5.2純化蛋白質(zhì)的產(chǎn)率低5.3蛋白質(zhì)分辨效果差5.4當(dāng)前第26頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)增加柱壓并輕敲柱壁的方法以除去氣泡，確保在引入任何溶液時(shí)不要產(chǎn)生氣泡樣品蛋白質(zhì)損失量允許的情況下，支撐物應(yīng)取出并清洗用高徑比較小的柱子過(guò)柱前的樣品要超聲或超濾處理產(chǎn)生氣泡樹(shù)脂基質(zhì)發(fā)生粘連層析柱太細(xì)細(xì)小顆粒堵柱5.1層析速度太慢問(wèn)題處理當(dāng)前第27頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)降低初始上樣緩沖液離子強(qiáng)度注意計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)樹(shù)脂應(yīng)充分平衡或用嚴(yán)格的再生方法初始上樣緩沖液離子強(qiáng)度過(guò)大樹(shù)脂pH值因解吸作用而發(fā)生變化樹(shù)脂未進(jìn)行適當(dāng)平衡或再生的樹(shù)脂未洗凈5.2蛋白質(zhì)不與樹(shù)脂結(jié)合問(wèn)題處理當(dāng)前第28頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)樹(shù)脂上的蛋白質(zhì)未洗凈pH值不合適或蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀水解酶破壞了目的蛋白或樹(shù)脂中有微生物滋生5.3純化蛋白質(zhì)的產(chǎn)率低增強(qiáng)溶液離子強(qiáng)度；更換活性高的反離子或使用去垢劑等方法解決。適當(dāng)調(diào)節(jié)PH蛋白提取過(guò)程中應(yīng)加水解酶抑制劑抑制蛋白水解問(wèn)題處理當(dāng)前第29頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)5.4蛋白質(zhì)分辨效果差流速太快或?qū)游鲋^(guò)短梯度洗脫時(shí)洗脫液濃度變化太快上柱蛋白質(zhì)過(guò)多降低流速可采用連續(xù)洗脫等梯度變化較慢的洗脫減少上樣量問(wèn)題處理當(dāng)前第30頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)6.應(yīng)用實(shí)例混合物的分離6.1蛋白質(zhì)的柱上復(fù)性6.2當(dāng)前第31頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)6.1混合物的分離Bio-Rex70層析分離眼鏡蛇神經(jīng)毒素的6種單乙?；苌镅坨R蛇神經(jīng)毒素，一種小分子堿性蛋白，分子中6個(gè)氨基（5個(gè)側(cè)鏈Lys殘基和一個(gè)游離的N端氨基）均能被乙?；梢阴；苌?形成的6種單乙?；苌镏袃綦姾蓴?shù)相同，但表面的電荷分布不同。據(jù)此，可以用Bio-Rex70將它們分開(kāi)。當(dāng)前第32頁(yè)\共有34頁(yè)\編于星期三\15點(diǎn)6.1混合物的分離兩步連續(xù)離子交換制備色譜分離純化PEG-rhG-SCF蛋白質(zhì)聚乙二醇化的反應(yīng)，生成非PEG化蛋白和不同程度的PEG化蛋白的混合物。因蛋白質(zhì)PEG化程度越高，其等電點(diǎn)越低，根據(jù)電荷量的差異，通過(guò)SP-SepharoseFF和SOURSEQ30作為陽(yáng)、陰離子色譜連續(xù)兩步將之分離開(kāi)來(lái)。當(dāng)前第33頁(yè)\共有