胰酶膠原酶的配制

胰酶-EDTA的配制1、專用PBS緩沖液配方:1000mlPBS:7.000gNaCl1.100gGlucose?H2O或1.000gGlucose0.3700gKCl0.2gNa2PO4H3.000gTris0.2400gKH2PO40.4000gEDTA超純水1000ml所有試劑全部為細(xì)胞培養(yǎng)專用sigma試劑。0.0010g 酚紅5ml PS2.5g胰酶（HyClone胰蛋白酶1:250SH30848.018）2、配制步驟:1） 所用容器先泡酸12小時(shí)，后用自來水洗至無色后用蒸餾水洗凈，再用超純水洗三遍，最后高壓滅菌，烘干。2） 將緩沖液配好后高壓滅菌，同時(shí)洗好的廣口瓶滅一瓶超純水備用。3） 加入5ml雙抗（PS）。4） 以滅菌的超純水補(bǔ)足高壓過程中損失的水分定容至1000ml。5） 轉(zhuǎn)移到1L的試劑瓶中，加入酚紅（0.0010g）。6） 調(diào)PH至7.2-7.4。7） 低溫冰浴中溶解Tryspin2.5g.混勻。此過程避免產(chǎn)生氣泡，否則將損失酶活性。8） 在細(xì)胞間里用0.22um的濾膜過濾，分裝入滅菌的50ml或1.5ml離心管中。此過程避免產(chǎn)生氣泡，否則將損失酶活性。-20°C保存。9） 不可反復(fù)凍存。每次解凍后4°C保存，并在短期內(nèi)用完。3、注意事項(xiàng)：1） 整個(gè)分裝過程在無菌條件下進(jìn)行。2） 機(jī)械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫酶就變性了。低溫可防止酶失活。3） 加入的EDTA可以絡(luò)合細(xì)胞外基質(zhì)中的Ca2+，增加消化效力。4） 在調(diào)節(jié)PH時(shí)一定要注意保護(hù)探頭，防止損傷電極。5） 分裝時(shí)不要太滿，防止凍存后體積增大而溢出。50ml離心管裝45ml左右，1.5ml離心管裝1.4ml左右。6） 分裝后的胰酶盡快轉(zhuǎn)移到-20°C冰箱中凍存。0.25%胰酶（無EDTA）的配制1、 250ml胰酶配制方法Tryspin 0.625gPS 2.5ml苯酚紅 0.1g所有試劑全部為細(xì)胞培養(yǎng)專用sigma試劑。2、 實(shí)驗(yàn)步驟1） 實(shí)驗(yàn)之前將所用試劑瓶泡酸12小時(shí)自來水清洗至無色后再用超純水沖洗并進(jìn)行高壓滅菌。2） 按前面要求準(zhǔn)確稱取所需試劑，在容量瓶中用0.01MPBS定容至250ml。3） 調(diào)節(jié)PH至7.4。4） 將所配制的胰酶在細(xì)胞間用0.22um的過濾器過濾并分裝。3、 注意事項(xiàng)1） 在溶解、分裝和過濾過程中要輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。否則酶的活性會受到影響。2） 為保持酶的活性，應(yīng)盡量在低溫下操作。3）胰酶配好后應(yīng)避免反復(fù)凍融。因此在過濾后將其分裝到1.5ml離心管中。膠原酶的配制方法1、 50ml體系配方組成Collagenase（Sigmac5138） 100mgPS 500ulHank's平衡培養(yǎng)液 49.5ml2、 配制步驟1） 向裝有100mgCollagenase的試劑瓶中加入1-2ml配制好的Hank's+PS使膠原酶溶解。反復(fù)輕輕顛倒幾下，但要注意觀察管蓋上的粉末是否也充分溶解。2） 12000rpm，離心20s，輕輕將其轉(zhuǎn)移到Hank's+PS