基因工程文庫的構建

（優(yōu)選）基因工程文庫的構建當前第1頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第2頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第3頁\共有49頁\編于星期五\7點構建基因文庫的基本程序：提取研究對象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉錄成cDNA；DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；重組DNA轉化宿主細胞或體外包裝后侵染受體菌；陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。當前第4頁\共有49頁\編于星期五\7點第一節(jié)基因組DNA文庫的構建一、基因組DNA文庫的類型和發(fā)展質粒文庫噬菌體文庫黏粒文庫人工染色體文庫亞基因組文庫當前第5頁\共有49頁\編于星期五\7點鳥槍法（霰彈法）：利用機械剪切力和超聲波等物理方法或限制性核酸內(nèi)切酶酶切等生化方法將生物chr.打斷，隨后通過T4DNA連接酶把這些片段與適當?shù)馁|粒載體進行重組，轉化受體菌后進行無性繁殖，獲得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用簡便的篩選方法從眾多的轉化菌株中篩選出含有某一目的基因的菌株，從中獲得所要的基因。當前第6頁\共有49頁\編于星期五\7點代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫質量的一個很重要的指標。文庫構建策略：①采用部分酶切或隨機切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；②提高文庫所含基因組DNA的總容量，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。二、文庫的代表性和隨機性當前第7頁\共有49頁\編于星期五\7點三、基因組DNA文庫構建流程載體的制備；高純度大分子量基因組DNA的提取；HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級分離（PFGEsizeselection）；載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；重組克隆的挑取和保存。當前第8頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第9頁\共有49頁\編于星期五\7點1．基因組DNA文庫的載體制備

載體的制備要求：①純度高；②去磷酸化好。2．高質量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切

提取的基因組DNA要求保存完整。分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。3．文庫的連接轉化或包裝侵染

在電轉化和包裝侵染過程中，首先選擇轉化效率高的感受態(tài)細胞或效價高且質量穩(wěn)定的包裝蛋白；同時，研究表明對連接產(chǎn)物進行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對于電轉化而言，選擇合適的轉化電壓對不同插入片段的DNA的轉化效率也有所不同。當前第10頁\共有49頁\編于星期五\7點4．文庫的質量檢測

文庫的平均插入片段長度是通過PFGE電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。美國的研究機構對BAC文庫，一般要求植物的在130kb左右，而動物的在150kb左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例?；蚪M覆蓋倍數(shù)＝平均插入片段長度×克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般是約數(shù)）；

基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對該基因位點的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩到的陽性克隆的總個數(shù)/使用的總探針數(shù)的比值

當前第11頁\共有49頁\編于星期五\7點第二節(jié)cDNA文庫的構建

cDNA文庫中的外源DNA片段是互補DNA（complementaryDNA,cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉錄后形成的雙鏈cDNA。cDNA文庫代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時期細胞內(nèi)轉錄水平上的基因的群體，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達豐度上存在很大差異。cDNA文庫構建步驟：細胞總RNA的提取和mRNA分離；第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA合成；雙鏈cDNA克隆進質?；蚴删w載體并導入宿主中繁殖。當前第12頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第13頁\共有49頁\編于星期五\7點

mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構建cDNA文庫和其它應用所必需進行的步驟。

目前mRNA的純化方法：在固體支持物表面共價結合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]鏈，由它與mRNA的Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進而將mRNA從其它組分中分離出來。

1．mRNA的完整性指導合成高分子量蛋白質的能力；指導合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS）；mRNA的大?。?00bp-8kb，多數(shù)1.5-2kb）；總mRNA制劑指導合成cDNA第一鏈長分子的能力。一、mRNA的分離當前第14頁\共有49頁\編于星期五\7點3．mRNA的富集

3.1按大小對mRNA進行分級分離

3.2cDNA的分級分離

近年來多采用此方法，特別是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分離大小易辨。

3.3多聚核糖體的免疫學純化法

用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體。

免疫親和柱/A蛋白-Sepharose柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結合到A蛋白-spharose柱上，隨后用EDTA解離下來，通過oligo（dT）層析分離mRNA。此法分離的mRNA只占總mRNA的0.01-0.05%。2．mRNA的豐度

高豐度mRNA：在特定細胞中占50-90%，如：免疫球蛋白。

低豐度mRNA：含量＜0.5%被稱為低豐度或稀有mRNA。當前第15頁\共有49頁\編于星期五\7點二、cDNA第一鏈的合成常用的反轉錄酶：AMV（來自禽成髓細胞瘤病毒）MMLV（來自Moloey鼠白血病病毒）依賴于RNA的DNA聚合酶，有5'--3'DNA聚合酶活性。合成DNA常用的引物：Oligo（dT）和隨機引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20個脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點的引物共同組成，隨機引物一般是包含6～10個堿基的寡核苷酸短片段。當前第16頁\共有49頁\編于星期五\7點

Oligo（dT）引導的cDNA合成是在cDNA的合成過程中加入高濃度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物與mRNA的3‘末端的poly（A）配對，引導反轉錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA。這種cDNA合成的方法在cDNA文庫構建中應用極為普遍，其缺點主要是由于cDNA末端存在較長的poly（A）而影響cDNA測序。

隨機引物引導的cDNA合成是采用6－10個隨機堿基的寡核苷酸短片段來錨定mRNA并作為反轉錄的起點。由于隨機引物可能在一條mRNA鏈上有多個結合位點而從多個位點同時發(fā)生反轉錄，比較容易合成特長的mRNA分子的5'-端序列。隨機引物cDNA合成的方法不適合構建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。當前第17頁\共有49頁\編于星期五\7點1．自身引導法：

首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3‘-末端就會形成一個發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈cDNA合成時的特性，原因至今未知，據(jù)推測可能是與帽子的特殊結構相關），并引導DNA聚合酶復制出第二鏈，此時形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點處為單鏈結構）切斷形成平端結構可以進行連接。三、cDNA第二鏈的合成當前第18頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第19頁\共有49頁\編于星期五\7點2．置換合成法：RNaseH：將mRNA－cDNA雜合雙鏈中的mRNA鏈切割成很多的小片段；大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：以形成的小片段為引物，以第一鏈cDNA為模板合成一段段互補的cDNA片段。DNA連接酶：合成的這些小cDNA片段被連接成一條鏈。當前第20頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第21頁\共有49頁\編于星期五\7點3．引導合成法：

本方法是Okayama和Berg1982提出的。首先是制備一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ和帶有Poly（dT）的載體片段Ⅰ，并用片段Ⅰ來代替Oligo（dT）進行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時進行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNaseH、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。其主要特點是合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對重組子的復制和測序都不利。當前第22頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第23頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第24頁\共有49頁\編于星期五\7點4．引物－銜接頭合成法第一鏈合成后直接采用末端轉移酶在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構建cDNA文庫的常用方法。當前第25頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第26頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第27頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第28頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第29頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第30頁\共有49頁\編于星期五\7點

cDNA克隆時常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長時間獲得全長cDNA克隆。cDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法獲得3‘末端和5’末端的序列。工作原理見后圖。篩選文庫時一般只能回收一個或幾個cDNA克隆，而RACE可產(chǎn)生大量獨立克隆。引物GSP1根據(jù)已經(jīng)得到的不完整的cDNA的序列設計。（3）RACE（randomamplificationofcDNAends）

當前第31頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第32頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第33頁\共有49頁\編于星期五\7點第三節(jié)基因克隆的篩選策略一般來說，這一篩選過程的難易程度，主要取決于所采用基因的克隆方案和目的基因的性質與來源。從文庫中篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的免疫學檢測法、PCR篩選法?；蚩寺〉谋举|：從文庫中篩選目標克隆，重點在篩選。常見篩選工具：探針（probe）狹義：核酸，抗體廣義：還包括其他篩選手段。當前第34頁\共有49頁\編于星期五\7點

生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過觀察表型的變化來篩選目的基因。表型篩選法就是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就很容易通過導入的基因帶來新的功能或恢復其缺失的功能來確定目的基因。一、表型篩選法抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因分解基因：苯環(huán)化合物、分解酶功能活性：殺蟲、酶啟動子/復制子：功能缺失：在獲得相應突變體的前提下，以此突變體作為宿主，將野生型的DNA導入后檢測回復突變（如：營養(yǎng)缺陷型相關的基因）。當前第35頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第36頁\共有49頁\編于星期五\7點

當目標基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質產(chǎn)物，此時就必須考慮其它的方法來篩選。雜交篩選法是應用最為廣泛的篩選目標基因克隆的一種方法。二、雜交篩選同源DNA探針：高度保守的基因rRNA基因鄰近種屬的相應基因相應基因的序列比較合成寡核苷酸：蛋白質N-末端aa序列簡并探針根據(jù)密碼子的使用頻率，合成猜測體探針設計兩組簡并探針，用第二個探針對第一次篩選的陽性克隆子作第二次雜交當前第37頁\共有49頁\編于星期五\7點實驗組mRNA&對照組mRNA

↓分別制備探針（mRNA或cDNA)

↓

分別篩選含目的基因的cDNA文庫

↓

陽性菌落x光底片顯色

↓

比較x光底片和對照平板，挑出含目的基因的菌落

↓鑒定目的基因(一)差別雜交(differentialhybridization

)優(yōu)點--簡便、直觀缺點--敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達基因--膜雜交篩選工作量大，信號強度可比性不佳當前第38頁\共有49頁\編于星期五\7點實驗組mRNA&對照組mRNA↓反轉錄為單鏈cDNA（量少）生物素標記mRNA（量多）

↓

雜交(約1:20)生物素標記mRNA：cDNA雜合子

↓

與鏈球菌抗生物素蛋白進行交聯(lián)反應生物素標記mRNA：cDNA雜合子交聯(lián)于鏈球菌抗生物素蛋白上

↓

去雙鏈結構

↓單鏈cDNA

↓制備差減探針&

構建差減cDNA文庫

↓差減cDNA文庫篩選

↓鑒定目的基因(二)mRNA減法雜交（subtractivehybridization)當前第39頁\共有49頁\編于星期五\7點原理：SSH是差減雜交與PCR結合的簡單、快速分離差異基因的方法。其運用雜交動力學原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；抑制PCR則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點，使非目的基因片段兩端反向重復序列在退火時產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補結構,無法作為模板與引物配對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。（三）抑制性差減雜交(suppressivesubtractivehybridization,SSH)當前第40頁\共有49頁\編于星期五\7點方法：提取實驗組和對照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識別4堿基的限制性內(nèi)切酶切割；實驗組cDNA平均分為2份，分別連接2個接頭；進行2輪差減雜交和抑制PCR；獲得富集的目的基因。當前第41頁\共有49頁\編于星期五\7點檢測組(Tester)—含目的基因cDNA，加接頭驅逐組(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接頭*接頭含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特異表達或高表達基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特異表達或高表達基因優(yōu)點：采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性(假陽性率可降至6％);在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達基因;操作相對簡便，是目前分離新基因的主要方法。缺點：起始材料需要g級量mRNA;SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度。當前第42頁\共有49頁\編于星期五\7點三、免疫篩選

免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細胞中存在抗原蛋白的表達，用于篩選的DNA文庫必須是表達文庫，通常是原核生物的基因組DNA文庫和真核生物的cDNA表達文庫。而且，所檢測的對象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達的基因。

四、高表達基因高豐度mRNA，如用苯肼做了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細胞中，血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數(shù)當前第43頁\共有49頁\編于星期五\7點mRNA3’末端有12種可能的序列；以此12種引物引導cDNA第一鏈合成；以10nt隨機引物引導cDNA第二鏈合成，可產(chǎn)生50-100條100-500bp的條帶；12種錨定引物和20種隨機引物組成240組引物，產(chǎn)生約20000種DNA條帶。五、mRNA差別顯示當前第44頁\共有49頁\編于星期五\7點當前第45頁\共有49頁\編于星期五\7點酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首