免疫組化的原理與操作

免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry當(dāng)前第1頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)概念：免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)是利用抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)呈色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)組織和細(xì)胞中某種化學(xué)成分的一門(mén)技術(shù),是傳統(tǒng)的免疫學(xué)和組織化學(xué)相結(jié)合而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興學(xué)科，也叫原位免疫學(xué)（Insituimmunology）。特點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高；（2）可定性、定位、定量觀察；（3）將形態(tài)學(xué)改變與功能和代謝變化結(jié)合起來(lái)；免疫組化概述當(dāng)前第2頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)IHC不僅具有傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)（包括LM和EM水平）能對(duì)組織和細(xì)胞進(jìn)行仔細(xì)、客觀觀察的優(yōu)點(diǎn)（特別是經(jīng)蘇木精或伊紅復(fù)染后），而且還克服了傳統(tǒng)免疫學(xué)反應(yīng)只能定性和定量（離體、液相），而不能定位的缺點(diǎn)。IHC則可在原位和固相對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行觀察。目前IHC的定位可精確到亞微結(jié)構(gòu)水平。

隨著IHC技術(shù)的發(fā)展和圖象分析技術(shù)的發(fā)展，IHC已進(jìn)入多標(biāo)記（雙標(biāo)記）和定量研究的階段，使IHC在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，不僅用于研究，也用于診斷。IHC與核酸分子雜交相結(jié)合形成的原位雜交技術(shù)（insituhybridization，ISH）既特異性強(qiáng)、靈敏，又具定位、可視的特點(diǎn)。當(dāng)前第3頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)——IHC技術(shù)源于免疫熒光術(shù)（immunofluorescence,IF），從1941年~1950年Coons等用了10年首創(chuàng)了

熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)——檢測(cè)肺組織內(nèi)的肺炎雙

球菌，六、七十年代IF在科研中占據(jù)著主導(dǎo)地位——1968年中根一穗（Nakane）等創(chuàng)建了酶標(biāo)抗體技

術(shù)（immunoperoxidase，IPO）——鐵蛋白標(biāo)記Ab技術(shù);

——1974年Stemberger改良上述技術(shù)，建立辣根過(guò)氧

化物酶－抗體過(guò)氧化物酶（PAP）技術(shù)，使免疫

細(xì)胞化學(xué)得到廣泛應(yīng)用；一、IHC的發(fā)展簡(jiǎn)史當(dāng)前第4頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)——80年代Hsu等建立了ABC法之后，免疫金—銀染色法、半抗原標(biāo)記法、免疫電鏡技術(shù)相繼問(wèn)世。——90年代分子雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)分類(lèi)方法迅速發(fā)展；——2000年各種免疫組化技術(shù)更加成熟，使免疫組化技術(shù)成為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)中形態(tài)、功能代謝綜合研究的一項(xiàng)有力工具。其應(yīng)用范圍深達(dá)醫(yī)學(xué)各個(gè)學(xué)科，是目前生命科學(xué)工作者應(yīng)該掌握的基本技術(shù)之一；——國(guó)內(nèi)起步晚，從70s開(kāi)始。當(dāng)前第5頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（一）方法學(xué)1.從傳統(tǒng)的抗原、抗體反應(yīng)（免疫反應(yīng)）→親和反應(yīng)。新的親和物質(zhì)對(duì)有：生物素與卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A蛋白（SPA）與IgG，凝集素與受體，激素與受體。這些親和對(duì)親和力強(qiáng)，且可與多種標(biāo)記物（熒光素、酶、同位素、膠體金、鐵蛋白等）結(jié)合，由此產(chǎn)生了親和組織化學(xué)（affinityhistochemistry），這些方法特異性、敏感性、穩(wěn)定性高，更方便、適于某些特殊觀察（如EM）。2.從單一顯示某種物質(zhì)（單標(biāo)記）→顯示多種物質(zhì)（雙標(biāo)記）。3.從LM→EM（超微結(jié)構(gòu)）：免疫電鏡、膠體金法、金銀法。4.從定性→定量，圖象分析（IA）、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。5.IHC與ISH相結(jié)合，可在不同水平檢測(cè)DNA、mRNA、protein。6.原位PCR+IHC可在組織原位通過(guò)擴(kuò)增檢測(cè)微量目的DNA。7.趨于標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化。二、IHC的現(xiàn)狀和發(fā)展前景當(dāng)前第6頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（二）技術(shù)分類(lèi)

1.根據(jù)染色方式分成：①貼片染色②漂浮染色2.根據(jù)Ag-Ab結(jié)合方式分成：①直接法②間接法③多層法

3.按標(biāo)記物的性質(zhì)分成：①免疫熒光技術(shù)（免疫熒光法）②免疫酶技術(shù)（酶標(biāo)抗體法、橋法、PAD法、ABC法）③免疫金屬技術(shù)（免疫鐵蛋白法、免疫金染色

法、蛋白A金法）當(dāng)前第7頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（三）標(biāo)記物1.必要性：組織細(xì)胞內(nèi)Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)一般是不可

見(jiàn)的，若在鏡下檢測(cè)，則必須具有可視性標(biāo)記物。

2.常用標(biāo)記物①熒光素：最常用的是異硫一氰酸熒光素（Fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）---熒光顯微鏡下呈綠色熒光;四乙基羅達(dá)明（rho—damineRB200）---熒光顯微鏡下發(fā)橙紅色熒光②酶：辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶。③生物素：（Biotin）④鐵蛋白金等：主要應(yīng)用于免疫電鏡。⑤其他：如同位素（因涉及污染和防護(hù)難一般不用）當(dāng)前第8頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（四）IHC的應(yīng)用1.

只要是形態(tài)科學(xué)均可采用:包括病理學(xué)、神經(jīng)科學(xué)、生物學(xué)、病原微生物的檢測(cè)（病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等）、皮膚病學(xué)、器官移植等。2.

可用于多種材料：A.各種組織（冰凍組織、formalin固定組織、石蠟包埋組織兼可）；B.各種細(xì)胞(穿刺、體液、涂片、血細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等）。3.

用于診斷：腫瘤病理學(xué)等（大中醫(yī)院）。4.

用于科研：臨床和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)，尤其是形態(tài)學(xué)專(zhuān)業(yè)研究生常用IHC，或IHC+分生技術(shù)；最近幾年，分子生物學(xué)研究異?；钴S，但最終還要?dú)w到形態(tài)上來(lái)，用免疫組織化學(xué)方法對(duì)所研究的大分子進(jìn)行定位，進(jìn)而深入研究其功能。當(dāng)前第9頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（一）標(biāo)本的收集與處理

IHC染色成功與否及其質(zhì)量如何，除染色方法本身外，對(duì)材料的處理也至關(guān)重要，它包括：取材、固定、脫水、包埋、切片等。目的：保存好Ag的數(shù)量及活性、保持組織細(xì)胞的良好形態(tài)結(jié)構(gòu)。材料的來(lái)源：人體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；細(xì)胞和組織；新鮮的及固定的。1、組織標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存來(lái)源：活檢取材、手術(shù)切除、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織等。要求：要快、要?。?×1×0.4cm），避免擠壓。處理：冰凍→即用或保存；固定→即用或保存。三、樣品的準(zhǔn)備、處理當(dāng)前第10頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

2、細(xì)胞標(biāo)本的取材與儲(chǔ)存來(lái)源：血細(xì)胞、穿刺細(xì)胞、體液細(xì)胞等。處理：細(xì)胞多時(shí)直接涂片、干燥、固定、染色；細(xì)胞少需離心沉淀、涂片、干燥、固定、染色；對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞：貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞（內(nèi)皮C、纖維C、神經(jīng)C等）在培養(yǎng)皿底置載玻片；懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞需離心沉淀，再涂片、固定，即用或冰凍保存。

當(dāng)前第11頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

（二）固定（fixation）

1、固定的含義

固定是指以某種化學(xué)物質(zhì)使蛋白質(zhì)、酶類(lèi)（變性）、脂質(zhì)、糖類(lèi)等物質(zhì)保持在組織細(xì)胞原位，避免Ag溶解、擴(kuò)散、丟失；保持組織細(xì)胞的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)。

根據(jù)Ag對(duì)固定劑的耐受性，可將其分為：不穩(wěn)定Ag（如細(xì)胞表面Ag，不耐甲醛，宜用丙酮）、半穩(wěn)定Ag及穩(wěn)定Ag，后二者多為蛋白、肽類(lèi)、酶類(lèi)物質(zhì)。固定有時(shí)間性，太短達(dá)不到固定目的，太長(zhǎng)交聯(lián)過(guò)度，封閉Ag。

當(dāng)前第12頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

2、常用固定劑及其用途1.10%的formalin（4%的甲醛formaldehyde）：以pH7.4的PBS配制，優(yōu)點(diǎn)：穿透力強(qiáng)、固定快、組織收縮??；適于固定蛋白、肽類(lèi)、酶、糖。IHC常用4%多聚甲醛polyformaldehyde灌注固定及后固定，時(shí)間4~6h。2.2.5%的戊二醛，同上。也可用2%戊二醛與2%多聚甲醛混合液固定，尤對(duì)超微結(jié)構(gòu)保存好。醛類(lèi)固定劑的缺點(diǎn)是易封閉抗原，必要時(shí)需抗原修復(fù)。3.70%的酒精（乙醇），優(yōu)點(diǎn)：固定蛋白好，缺點(diǎn)：組織收縮嚴(yán)重；時(shí)間：2h。4.70%丙酮，優(yōu)點(diǎn)：滲透快；缺點(diǎn)：對(duì)形態(tài)保存不好；用于對(duì)冰凍切片和細(xì)胞涂片的固定；時(shí)間：10min。5.混合固定液：Bouin液：40%PF250ml、冰醋酸50ml、飽和苦味酸250ml；還有PLP固定液，較適合免疫組化。6.四氧化鋨（OsO4鋨酸）：常用PBS配制1%鋨酸溶液后固定1h，用于免疫組化及電鏡觀察。有強(qiáng)烈刺激，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。當(dāng)前第13頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（三）組織的脫水、浸蠟、包埋和切片

前三步只用于石蠟切片，冰凍切片和振動(dòng)切片不需此步驟。切片可分為：石蠟切片：脫水、透明、浸蠟、包埋、切片5~7μm；冰凍切片：浸糖，20%~30%蔗糖4oC過(guò)夜，減少冰晶；OCT包埋；液氮速凍，減輕組織破壞。病理切片要薄，5~7μm；腦片通常

30~50μm厚。振動(dòng)切片：不需做任何包埋，固定后的組織可直接用振動(dòng)切片機(jī)做各種厚度的切片，并在染色后可進(jìn)一步制作電鏡標(biāo)本觀察。

當(dāng)前第14頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（四）防脫片劑

（1）

蛋白甘油，蛋清與甘油1：1攪拌、過(guò)濾、防腐；（2）1%的鉻礬明膠涂片；（3）0.1%的多聚賴(lài)氨酸涂片，晾干備用。配制時(shí)用塑料瓶而不能用玻璃瓶；

（4）

購(gòu)買(mǎi)商品化的進(jìn)口硅化玻片；

（5）APES（氨丙基三乙氧基硅烷），1：50丙酮稀釋?zhuān)?0~30秒，晾干備用；貼片時(shí)要一步到位。當(dāng)前第15頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（五）抗原修復(fù)

近年興起的新技術(shù)。目的：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。主要適用于經(jīng)長(zhǎng)期formalin固定的標(biāo)本、石蠟包埋標(biāo)本；也可用于冰凍切片。常用的方法有：（1）

微波加熱切片煮沸10~20min，室溫自然冷卻，所用溶液有：①飽和NaCL溶液；②10mMpH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液；③4M的尿素等；④pH8.0TBS;（2）高壓鍋處理將切片放入10mM、pH6.0的枸櫞酸鈉緩沖液容器中，置鍋內(nèi)加蓋噴氣3~10min，自然冷卻。（3）酶消化處理：常用0.1%的胰蛋白酶（含0.1%CaCL2，pH7.8）37。C10min?；?.4%胃蛋白酶37。C30min;當(dāng)前第16頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

（一）基本染色方法

熒光素標(biāo)記抗體：FITC、直接法TRITC等標(biāo)記抗體法酶標(biāo)記抗體：HRP、AP等

熒光素標(biāo)記抗體間接法

酶標(biāo)記抗體（三步法）

非標(biāo)記抗體法：酶橋法、PAP法、APAAP法;

親和組化法：ABC法、LAB法、LsAB法、BRAB法;

雙重標(biāo)記：阻斷法（酸洗Ⅰ抗）、非阻斷法（連續(xù)染）四、免疫組織化學(xué)技術(shù)當(dāng)前第17頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)1．直接法

熒光素直接標(biāo)記特異性抗體（一抗）上，標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合（在切片上）熒光顯微鏡下觀察→檢測(cè)抗原。

優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，時(shí)間短，

特異性強(qiáng)。

缺點(diǎn)：靈敏度低，所

需抗體量大

（不經(jīng)濟(jì)）。

應(yīng)用：基本不用了?。‘?dāng)前第18頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2．間接法

熒光素標(biāo)記在二抗上（二抗：抗產(chǎn)生一抗動(dòng)物的IgG抗體）?！@色后鏡檢特點(diǎn)：1、敏感性較直接法高3-4倍，但特異性較低；2、不必標(biāo)記每種一抗，只需標(biāo)記某一種動(dòng)物的二抗；3、一抗可高度稀釋?zhuān)?jié)省一抗，且可用PBS代替一抗做空白對(duì)照。當(dāng)前第19頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)3．非標(biāo)記Ab橋法：

“橋法”是酶標(biāo)記抗體的改進(jìn)，經(jīng)過(guò)三次抗體，其二抗為未標(biāo)記橋抗體。（1）單橋法當(dāng)前第20頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)(2)雙橋法

在三抗之后，將二抗和三抗再重復(fù)一次，可增大染色強(qiáng)度?！锾貏e提示：注意動(dòng)物種屬關(guān)系

特點(diǎn)：敏感性高，但酶濃度不好掌握；與組織非特異性結(jié)合的酶不易洗去，背景染色重。當(dāng)前第21頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)4．過(guò)氧化物酶—抗過(guò)氧化物酶法（Peroxidaseanti-peroxidasemethod，簡(jiǎn)稱(chēng)PAP法）

是橋法的改良，用第二抗體作“橋梁”，先與第一抗體結(jié)合，再與PAP復(fù)合物聯(lián)結(jié)，形成抗原—抗體—抗IgG抗體—PAP復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。特點(diǎn)：靈敏度高，比間接熒光法敏感20倍，比間接酶標(biāo)記抗體法敏感100倍當(dāng)前第22頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

5．親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplextechnique，簡(jiǎn)稱(chēng)ABC法）。

關(guān)鍵的程序步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+AB★C

復(fù)合物（Ab2-B

為生物素標(biāo)記的第二抗體）（B★為生物素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶）

AB★C復(fù)合物是avidin與酶聯(lián)biotin在使用前30min配置，混勻。1個(gè)avidin分子結(jié)合了3個(gè)biotin分子，剩下1個(gè)結(jié)合點(diǎn)與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。當(dāng)前第23頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（1）ABC復(fù)合物的制備：（2）ABC法反應(yīng)原理：特點(diǎn)：ABC法敏感性更高，比PAP法敏感20~40倍，背景也更清晰。當(dāng)前第24頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)ABC法示意圖當(dāng)前第25頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)染色結(jié)果觀察（BrdU）當(dāng)前第26頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)

6、酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)（labelledavidin-biotintechnique，簡(jiǎn)稱(chēng)LAB法）。即用辣根過(guò)氧化物酶直接標(biāo)記avidin，用biotin標(biāo)記2抗。關(guān)鍵步驟為3步：

Ag+Ab1+（Ab2-B）+A★

（A★為HRP標(biāo)記的卵白素）

A★與2抗的生物素結(jié)合，avidin起橋聯(lián)作用。如將該法中的卵白素（avidin）變換成鏈霉卵白素(streptavidin)，LAB法即成LsAB法，或稱(chēng)SP法。據(jù)認(rèn)為L(zhǎng)AB法比ABC法敏感2~4倍，而LsAB法因鏈霉卵白素不與組織細(xì)胞中內(nèi)源性生物素結(jié)合而特異性更高?，F(xiàn)在SP法已趨于取代ABC法而廣為應(yīng)用。當(dāng)前第27頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)生物素化Ⅱ抗AB復(fù)合物酶標(biāo)鏈卵白素AvidinBiotinPeroxidaseⅠ抗組織抗原ABC法（3步完成）LsAB（SP）法（3步完成）當(dāng)前第28頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)鏈霉卵白素酶生物素底物抗原SP法示意圖當(dāng)前第29頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（二）免疫組化染色步驟（以ABC法為例）

1)、切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯雖然可以反復(fù)使用，但次數(shù)不宜多。乙醇的濃度是從高到低，與脫水時(shí)相反。

2)、滅活內(nèi)源性酶：博士德推薦應(yīng)用3%的雙氧水，但實(shí)際操作中，使用30%雙氧水和純甲醇按1:9的溶劑比混合較為理想。

3)、抗原修復(fù)：暴露被交聯(lián)封閉的Ag。

4)、正常山羊血清封閉：封閉時(shí)應(yīng)該注意室溫與時(shí)間的相對(duì)關(guān)系。室溫低，時(shí)間就要長(zhǎng)一些，反之亦然。另外，保持反應(yīng)池濕潤(rùn)是重要的一環(huán)，否則，前功盡棄。后面的步驟也是如此。

5)、一抗反應(yīng)：一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度與背景有直接關(guān)系。一般說(shuō)來(lái)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度不夠時(shí)，可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間；背景過(guò)高時(shí)則相反。

孵育時(shí)間與溫度：抗原抗體充分反應(yīng)是得到可靠結(jié)果的關(guān)鍵。因此，控制溫度與時(shí)間也是一個(gè)嚴(yán)肅的問(wèn)題。由于室溫控制較為困難，建議4℃冰箱過(guò)夜（≥18h）。當(dāng)前第30頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)6)、二抗（生物素化IgG）反應(yīng)：建議濕盒內(nèi)37OC1h，另外儀器顯示溫度37℃，但實(shí)際只有23℃，自然結(jié)果難以令人滿(mǎn)意。

7)、SABC染色（37℃）：這是博士德的人性化之處，直接就可以用。

8)、DAB顯色鏡下控時(shí)：DAB濃度應(yīng)該比推薦的要低一些，這樣可以便于控制反應(yīng)時(shí)間以及在合適的時(shí)候中止反應(yīng)。同時(shí)注意，使用后殘余的DAB應(yīng)妥善處理，而不是隨便倒入下水道，因?yàn)樗兄掳┬浴?/p>

9)、蘇木素輕度復(fù)染：不建議使用。盡管復(fù)染后標(biāo)本層次分明，但實(shí)際情況是，這樣有時(shí)也會(huì)掩蓋陽(yáng)性結(jié)果，從而使前功盡棄。

10)、脫水透明：脫水乙醇的濃度由低到高，有一個(gè)較準(zhǔn)確判斷脫水成功與否的辦法是：觀察透明后盛二甲苯容器的壁，若發(fā)現(xiàn)白色霧狀現(xiàn)象，則說(shuō)明脫水不成功，應(yīng)再次脫水。透明時(shí)間不要太長(zhǎng)，1分鐘左右就可以了。

11)、封片：封片時(shí)，中性樹(shù)脂量宜少，同時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡。當(dāng)前第31頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)（三）免疫組化染色基本技術(shù)及注意事項(xiàng)1．實(shí)驗(yàn)計(jì)劃根據(jù)課題的內(nèi)容選用動(dòng)物，選用配套的Ab。如Ab-I鼠抗人的抗體，與其他種屬間無(wú)交叉，則不能用其他動(dòng)物，而且Ab-Ⅱ必須是羊抗鼠，若PAP法Ab-Ⅲ必須來(lái)源于鼠，否則不能連接成復(fù)合物②若要比較染色深淺在對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間的差異，在貼片方面最好貼于同一張載片上，否則無(wú)可比性。③選用的試劑可靠，貨源充足，隨時(shí)可取。當(dāng)前第32頁(yè)\共有39頁(yè)\編于星期五\2點(diǎn)2．Ab稀釋度（如系購(gòu)買(mǎi)的藥盒有工作液和原液）（1）工作液：無(wú)須稀釋?zhuān)?）原液：應(yīng)參照其提供的工作液濃度進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)原液的保存（-20℃）凍存——應(yīng)選最佳稀度凍存。③若工作濃度大于1∶500則要先將原液稀釋十倍，而后分裝10μl/瓶→凍存（-20℃）于冰箱備用。（3）Ab濃度的選擇

Ab濃度不可太高或太低，因?yàn)锳g-Ab結(jié)合需在一定濃度范圍內(nèi)進(jìn)行，若一方過(guò)剩則形成復(fù)合物小且少；極過(guò)剩時(shí)已形