副溶血性弧菌演示文稿

副溶血性弧菌演示文稿當(dāng)前第1頁\共有39頁\編于星期五\3點目錄一、引起疾病癥狀（致病性、流行病學(xué)情況）二、基本情況及特征三、培養(yǎng)特性四、生化特性五、抗原特征六、檢驗方法（舉例闡述檢驗?zāi)骋皇称贰⑸唐分性摼脑敿毑僮鬟^程）當(dāng)前第2頁\共有39頁\編于星期五\3點一.副溶血性弧菌疾病癥狀副溶血性弧菌（BibrioParahemolyticus），進食含有該菌的食物致可食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒。副溶血弧性菌常導(dǎo)致腸胃不適，伴隨食物中毒等癥狀。表現(xiàn)為急性腸胃炎，腹痛、吐瀉、發(fā)燒等特征。少數(shù)重癥者引起原發(fā)性敗血癥。當(dāng)前第3頁\共有39頁\編于星期五\3點副溶血性弧菌的發(fā)現(xiàn)于1950年10月從日本大阪市，發(fā)生的一起咸沙丁魚食物中毒，患者腸道排泄物和食物中首次分離出副溶血性弧菌。在日本，副溶血性弧菌食物中毒約占細菌性食物中毒的70%～80%.1958年上海市防疫站也從烤鴨所致食物中毒的患者中分離出此菌。以后在我國、日本、印度、美國等許多國家均陸續(xù)報道有本病的發(fā)生。1966年國際弧菌命名委員會正式命名為副溶血性弧菌。當(dāng)前第4頁\共有39頁\編于星期五\3點

中毒食品主要是海產(chǎn)品魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品，其次為咸菜、熟肉類、禽肉、禽蛋類，約有半數(shù)中毒者為食用了腌制品后。中毒原因主要是烹調(diào)時未燒熟煮透或熟制品被污染．當(dāng)前第5頁\共有39頁\編于星期五\3點副溶血性弧菌致病性致病因子：

1、耐熱直接溶血素TDH，腸毒素

2、耐熱相關(guān)溶血素TRH，與TDH

相似。當(dāng)前第6頁\共有39頁\編于星期五\3點副溶血性弧菌的流行病學(xué)1、傳染源傳染源為病人，集體發(fā)病時往往僅少數(shù)病情嚴重者住院，而多數(shù)未住院者可能成為傳染源，但由于病人僅在疾病初期排菌較多，其后排菌迅速減少，故不至因病人散布病菌而造成廣泛流行。2、傳播途徑本病經(jīng)食物傳播，主要的食物是海產(chǎn)品或鹽腌漬品，常見者為蟹類、烏賊、海蜇、魚等，其次為蛋品、肉類或蔬菜。進食肉類或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。3、易感者男女老幼均可患病，但以青壯年為多，病后免疫力不強，可重復(fù)感染。本病多發(fā)生于夏秋沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來沿海地區(qū)發(fā)病有增多的趨勢。當(dāng)前第7頁\共有39頁\編于星期五\3點預(yù)防措施1、動物性食品應(yīng)煮熟煮透再吃。2、注意海鮮是否干凈、新鮮，食前應(yīng)用淡水反復(fù)沖洗，吃時煮熟煮透，再加適量食醋；3、生熟食品分開存放，裝海產(chǎn)品的器具及接觸海產(chǎn)品的手應(yīng)洗凈擦干再接觸其他食品。當(dāng)前第8頁\共有39頁\編于星期五\3點二、基本情況及特征

大?。?.7~1.0μm，有時有絲狀菌體，可長達15μm特征：一端有鞭毛，運動活潑，菌周有鞭毛當(dāng)前第9頁\共有39頁\編于星期五\3點

革蘭染色陰性需氧菌,無芽孢，兩端有濃染現(xiàn)象，其中間著色較淡或不著色。當(dāng)前第10頁\共有39頁\編于星期五\3點菌體形態(tài)呈多型性，主要出現(xiàn)的形態(tài)有球狀、球桿狀、卵圓狀和絲狀。

當(dāng)前第11頁\共有39頁\編于星期五\3點三、培養(yǎng)特性1、需氧菌，需氧性很強，營養(yǎng)要求不高。2、在含鹽3～3.5%培養(yǎng)基中生長最好，無鹽條件下不能生長。3、最適溫度30~37℃，PH7.4~8.0。4、不耐熱，不耐冷，不耐酸，對常用消毒劑抵抗力弱。當(dāng)前第12頁\共有39頁\編于星期五\3點在液體培養(yǎng)基中，呈現(xiàn)渾濁，表面形成菌膜，R型菌發(fā)生沉淀。在固體培養(yǎng)基上的菌落通常為隆起，圓形，稍混濁，不透明，表面光滑濕潤，傳代之后出現(xiàn)不圓整、粗糙型菌落，或灰白色半透明或不透明的菌落。在血瓊脂平板上菌落的周圍可見溶血環(huán)，某些菌株可形成β溶血或α溶血。當(dāng)前第13頁\共有39頁\編于星期五\3點本菌在伊紅美蘭瓊脂上不生長，某些菌株在麥康凱上生長，生長的菌落呈圓形，平坦、半透明或渾濁，略帶紅色。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基主要成分：蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅、美藍、瓊脂粉、蒸餾水。麥康凱培養(yǎng)基：蛋白胨17g，脙胨3g，豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g，氯化鈉5g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL，乳糖10g，0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL，0.5%中性紅水溶液5mL當(dāng)前第14頁\共有39頁\編于星期五\3點在SS平板上，菌落中等大小，長出1～2mm扁平、無色、半透明的菌落，不易挑起，挑起時呈粘稠狀。當(dāng)前第15頁\共有39頁\編于星期五\3點

典型的副溶血性弧菌在TCBS瓊脂培養(yǎng)基呈圓形、半透明、表而光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm--3

mm

。注：TCBS中文名：硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基。成分：酵母粉5.0,蛋白胨10.0,硫代硫酸鈉10.0,枸櫞酸鈉10.0,牛膽粉5.0,牛膽酸鈉3.0,蔗糖20.0,氯化鈉10.0,檸檬酸鐵1.0,麝香草酚蘭0.04,瓊脂15.0,pH值8.6±0.1,當(dāng)前第16頁\共有39頁\編于星期五\3點典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上呈圓形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2mm--3

mm.

注：顯色培養(yǎng)基成分：特殊營養(yǎng)物質(zhì)（75.0g/L）、混合顯色劑（2.3g/L）、瓊脂（15.0g/L）。顯色培養(yǎng)基是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理來檢測微生物的新型培養(yǎng)基。當(dāng)前第17頁\共有39頁\編于星期五\3點四、生化特性能分解葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、淀粉和阿拉伯膠糖，產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣。不發(fā)酵乳糖、蔗糖、纖維二糖等。從患者樣品中分離的致病菌株在人或家兔紅細胞的培養(yǎng)基中生長，能產(chǎn)生β溶血。海水中及海產(chǎn)品中分離的菌株不溶血，這個現(xiàn)象稱為“神奈川現(xiàn)象”。能在神奈川培養(yǎng)基上產(chǎn)生β溶血者，稱為神奈川實驗陽性。當(dāng)前第18頁\共有39頁\編于星期五\3點試驗項目結(jié)果革蘭氏染色鏡檢陰性，無芽孢氧化酶+動力+蔗糖-葡萄糖+甘露醇+分解葡萄糖產(chǎn)氣-乳糖-硫化氫-賴氨酸脫羧酶+VP-ONPG-陽性：+陰性：-副溶血性弧菌的生化性狀當(dāng)前第19頁\共有39頁\編于星期五\3點

3

％氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深。當(dāng)前第20頁\共有39頁\編于星期五\3點嗜鹽性試驗挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰胨水，36℃±1℃培養(yǎng)24h，觀察液體混濁情況。副溶血性弧菌在無氯化鈉和10%氯化鈉的胰胨水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉和8%氯化鈉的胰胨水中生長旺盛。

當(dāng)前第21頁\共有39頁\編于星期五\3點

嗜鹽性試驗6％NaCL10％NaCl當(dāng)前第22頁\共有39頁\編于星期五\3點MR

試驗方法

MR試驗方法：取一種細菌的24h培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)48～72h，取出后加甲基紅試劑3～5滴，凡培養(yǎng)液呈紅色者為陽性，以‘‘十”表示；橙色者為可疑，以“±”表示；黃色者為陰性，以“—”表示。當(dāng)前第23頁\共有39頁\編于星期五\3點VP試驗方法

VP試驗方法

：取一種細菌的24h純培養(yǎng)物，接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，置37'C培養(yǎng)48～72h取出后在培養(yǎng)液中先加VP試劑甲液0.6mL，再加乙液0.2mL，充分混勻。靜置在試管架上，15min后培養(yǎng)液呈紅色者為陽性，以“”表示；不變色為陰性，以“—”表示。1h后可出現(xiàn)假陽性?；蛘呖梢杂玫攘康牧蛩徙~試劑于培養(yǎng)液中混合，靜置，強陽性者約5min后就可產(chǎn)生粉紅色反應(yīng)。

當(dāng)前第24頁\共有39頁\編于星期五\3點MR:陽性（紅色）左側(cè)為陰性對照VP：陰性當(dāng)前第25頁\共有39頁\編于星期五\3點五、抗原的特征O抗原是耐熱的菌體抗原，目前有O1~O13共13種，可用于血清學(xué)鑒定。K抗原是一種莢膜抗原，現(xiàn)有K1~K71，也用于血清學(xué)鑒定。中國大陸副溶血弧菌大部分是O3：K6。當(dāng)前第26頁\共有39頁\編于星期五\3點六、檢驗實驗?zāi)壳案比苎曰【臋z驗采用國標(biāo)法（GB/T4789.7—2013）設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃；b)冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃；c)恒溫水浴箱：36℃±1℃；d)均質(zhì)器或無菌乳缽；e)天平：感量0.1g；f)無菌試管：18mm×180mm、15mm×100mm；g)無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭；h)無菌錐形瓶：容量250mL、500mL、1000mL；i)無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm；j)全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)；k)無菌手術(shù)剪、鑷子。當(dāng)前第27頁\共有39頁\編于星期五\3點

培養(yǎng)基和試劑3％氯化鈉堿性蛋白胨水、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖（TCBS）瓊脂、3％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、3％氯化鈉三糖鐵瓊脂、嗜鹽性試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉甘露醇試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、3％氯化鈉MR-VP培養(yǎng)基、3％氯化鈉溶液、我妻氏血瓊脂、氧化酶試劑、革蘭氏染色液、ONPG試劑、Voges-Proskauer（V-P）試劑、弧菌顯色培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒。當(dāng)前第28頁\共有39頁\編于星期五\3點副溶血性弧菌檢驗程序當(dāng)前第29頁\共有39頁\編于星期五\3點

1.樣品制備

冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15min或在2-5℃不超過18小時解凍。非冷凍而易腐蝕的樣品應(yīng)盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應(yīng)置7-10℃冰箱保存，在24h內(nèi)檢驗。魚類和頭足類動物取表面組織、腸或鰓.貝類取全部內(nèi)容物,包括貝肉和體液,甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分,包括腸和鰓。以無菌操作取檢樣25g（或ml），加人3％氯化鈉堿性蛋白棟水225ml，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min取均質(zhì)1min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2min，制備成1：10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將樣品放人無菌乳缽中磨碎，然后放500mL的滅菌容器內(nèi),加225ml3%氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。當(dāng)前第30頁\共有39頁\編于星期五\3點2、增菌（1）定性檢測將制備好的1:10樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。（2）定量檢測用無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的樣品勻液。另取1mL無菌吸管，按之前操作程序，依次制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支1mL無菌吸管。根據(jù)對檢樣污染情況的估計，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種3支含9mL3%氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8h～18h。當(dāng)前第31頁\共有39頁\編于星期五\3點

3.分離

a.對所有顯示生長的增菌液，用接種環(huán)在距離液面以下1cm內(nèi)沾取一環(huán)增菌液，于TCBS平板或弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。b.典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圓形、半透明、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2mm～3mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡快（不超過1h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌顯色培養(yǎng)基上的特征按照產(chǎn)品說明進行判定。當(dāng)前第32頁\共有39頁\編于星期五\3點4.純培養(yǎng)

挑取三個或以上可疑菌落，劃線3

％氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36

℃

土l

℃

培養(yǎng)18h--24h.當(dāng)前第33頁\共有39頁\編于星期五\3點5.初步鑒定

氧化酶試驗

挑選純培養(yǎng)的單個菌落進行氧化酶試驗，副溶血性弧菌為氧化酶陽性。涂片鏡檢

將可疑菌落涂片，進行革蘭氏染色．鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛.3﹪氯化鈉三糖鐵瓊脂

挑取純培養(yǎng)的單個可疑菌落，轉(zhuǎn)種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深。嗜鹽性實驗當(dāng)前第34頁\共有39頁\編于星期五\3點6.確定鑒定取純培養(yǎng)物分別接種含3%氯化鈉的甘露醇試驗培養(yǎng)基、賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、MR-VP培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h后觀察結(jié)果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養(yǎng)物進行ONPG試驗。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)。

當(dāng)前第35頁\共有39頁\編于星期五\3點ONPG試驗β-半乳糖苷酶試驗（ONPG試驗）簡介（1）β-半乳糖苷酶試驗原理：有的細菌可產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，能分解鄰-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黃色的鄰-硝基酚，在很低濃度下也可檢出。（2）試劑：0.75MONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸餾水中，在加入緩沖液（6.9gNaH2P04溶于45ml蒸餾水中，用30%NaOH調(diào)整pH為7.0，再加水至50ml）5ml，置4℃冰箱中保存。0NPG溶液為無色，如出現(xiàn)黃色，則不應(yīng)再用。（3）方法：從培養(yǎng)基上取菌，于0.25ml無菌生理鹽水中制成菌懸液，加入一滴甲苯并充分振搖，使酶釋放。將試管置37℃水浴5min，加入0.25mlONPG試劑，水浴20min～3h