分子生物學(xué)第三章蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)與功能

本章內(nèi)容第一節(jié)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)與功能第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成1當(dāng)前第1頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)第一節(jié)蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)與功能2當(dāng)前第2頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)一、蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義（功能）蛋白質(zhì)的生物學(xué)意義（功能）結(jié)構(gòu)功能例如：膜蛋白、糖蛋白、核蛋白催化功能例如：酶運(yùn)輸功能例如：載體，某些跨膜蛋白運(yùn)動功能例如：肌球蛋白和肌動蛋白防御功能例如：抗體調(diào)控功能例如：阻遏蛋白,再激活因子恩格斯認(rèn)為：蛋白質(zhì)是生命的表現(xiàn)形式3當(dāng)前第3頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)膜蛋白4當(dāng)前第4頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)HA鏈球菌透明質(zhì)酸的代謝網(wǎng)絡(luò)透明質(zhì)酸生物合成過程5當(dāng)前第5頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)糖蛋白生物膜是磷脂雙分子層嵌有蛋白質(zhì)的二維流體6當(dāng)前第6頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的主動運(yùn)輸（載體蛋白）與被動運(yùn)輸（載體蛋白和通道蛋白）7當(dāng)前第7頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)TheProtonPump8當(dāng)前第8頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)問題先有蛋白質(zhì)，還是先有核酸？先有DNA,還是先有RNA?9當(dāng)前第9頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)二、蛋白質(zhì)的元素組成四大生命元素：C、H、O、N有的蛋白質(zhì)還有：磷、鐵、鋅、銅、鉬等氮在各種蛋白質(zhì)中平均含量為16%。例題:通過凱氏定氮法測得某細(xì)菌培養(yǎng)物的N含量為1.25g,問該細(xì)菌中蛋白質(zhì)含量為多少?

10當(dāng)前第10頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)三、蛋白質(zhì)的氨基酸組成組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸。如將天然蛋白質(zhì)完全水解，最后都可得到約二十種不同的氨基酸。除脯氨酸外，其余均屬于α-氨基酸11當(dāng)前第11頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)12當(dāng)前第12頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)(一)氨基酸結(jié)構(gòu)通式羧基寫在α-碳原子上端，氨基在左邊為L-型，氨基在右邊為D-型13當(dāng)前第13頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)(二)氨基酸的分類根據(jù)組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸的側(cè)鏈R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分為：脂肪族氨基酸：甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸芳香族氨基酸：苯丙氨酸雜環(huán)氨基酸：組氨酸、色氨酸雜環(huán)亞氨基酸：脯氨酸

14當(dāng)前第14頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)根據(jù)R側(cè)鏈基團(tuán)解離性質(zhì)的不同，可將氨基酸進(jìn)行分類：

1.極性氨基酸：(1)酸性氨基酸——Glu，Asp；側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中解離后帶負(fù)電荷的氨基酸。

(2)堿性氨基酸——His，Arg，Lys；側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中解離后帶正電荷的氨基酸。

(3)中性氨基酸——側(cè)鏈基團(tuán)在中性溶液中不發(fā)生解離，因而不帶電荷的氨基酸：Ser,Thr,Asn,Gln,Tyr,Cys

2.非極性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。

15當(dāng)前第15頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（三）氨基酸的理化性質(zhì)1．兩性解離及等電點(diǎn)氨基酸分子是一種兩性電解質(zhì)。通過改變?nèi)芤旱膒H可使氨基酸分子的解離狀態(tài)發(fā)生改變。

氨基酸分子帶有相等正、負(fù)電荷時，溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。

16當(dāng)前第16頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)17當(dāng)前第17頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2．紫外吸收性質(zhì)組成天然蛋白質(zhì)分子的20種氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸對紫外光有光吸收。其吸收峰280nm左右，以色氨酸吸收最強(qiáng)?？衫么诵再|(zhì)采用紫外分分光度法測定蛋白質(zhì)的含量。18當(dāng)前第18頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)3.氨基酸的化學(xué)性質(zhì)與茚三酮反應(yīng)生成蘭紫色物質(zhì)，但脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮生成黃色物質(zhì)。與DNFB反應(yīng)生成穩(wěn)定的黃色2，4-二硝基苯氨酸（DNP-氨基酸）。DNP-氨基酸在有機(jī)溶劑中與其它氨基酸溶解度不同，用乙醚抽提，根據(jù)紙層析上的黃色斑點(diǎn)可鑒定N-端氨基酸的種類和數(shù)目（Sanger等用此法測定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)）19當(dāng)前第19頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)氨基酸與異硫氰酸苯酯的反應(yīng)AA的氨基可與異硫氰酸苯酯(PITC)反應(yīng),生成苯氨基硫甲酰氨基酸(PTC-AA)。所得PTC-AA經(jīng)乙酸乙酯抽提→層析鑒定→確定N端氨基酸的種類?！岸嚯捻樞蜃詣臃治鰞x”據(jù)此原理。生物公司已經(jīng)進(jìn)行蛋白質(zhì)測序20當(dāng)前第20頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)英國生化學(xué)家弗雷德·桑格爾（FrederickSanger，1918年8月13日—）,分別獲得1958年和1980年諾貝爾化學(xué)獎。他是同一領(lǐng)域內(nèi)兩次獲獎，兩次獲獎理由都可歸結(jié)為：測序。1958：弗雷德·桑格爾發(fā)明酶法測定人胰島素序列，從而確定胰島素的分子結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)了蛋白質(zhì)測序領(lǐng)域。1980：弗雷德·桑格爾、沃爾特·吉爾伯特共同榮獲諾貝爾化學(xué)獎。他們貢獻(xiàn)在于：分別使用不同的方法測定DNA序列。Sanger法后來成為主流，并用于人類基因組計劃（HGP）的測序。21當(dāng)前第21頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)22當(dāng)前第22頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)四、肽肽：一個AA的α-羧基和另一個AA的α-氨基脫水縮合而成的化合物。肽建：氨基酸之間脫水后形成的鍵，又稱酰胺鍵23當(dāng)前第23頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)肽鏈中的氨基酸因脫水形成肽鍵而稱為氨基酸殘基肽的命名：例如谷胱甘肽肽與蛋白質(zhì)的界定信號肽24當(dāng)前第24頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)25當(dāng)前第25頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)肽平面26當(dāng)前第26頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)肽的實例谷胱甘肽作為輔酶，在體內(nèi)氧化還原過程中起作用催產(chǎn)素和加壓素促腎上腺皮質(zhì)激素腦肽27當(dāng)前第27頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)28當(dāng)前第28頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)四、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為：一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)（一）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序。一級結(jié)構(gòu)在很大程度上決定其高級結(jié)構(gòu)。29當(dāng)前第29頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)二硫鍵30當(dāng)前第30頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)一級結(jié)構(gòu)確定的原則測定蛋白質(zhì)中氨基酸組成蛋白質(zhì)N端和C端的測定2種以上方法水解蛋白質(zhì)，得到一系列肽段分離提純所得肽，測其序列從有重疊結(jié)構(gòu)的肽序列中推斷蛋白質(zhì)的全部氨基酸的排列順序31當(dāng)前第31頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)肽平面：肽腱中的4個原子以及相鄰的2個α-碳原子處在同一平面，使肽鏈具有一定的穩(wěn)定性32當(dāng)前第32頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)1.蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、自由回轉(zhuǎn)等α-螺旋結(jié)構(gòu)特點(diǎn):每隔3.6個氨基酸殘基上升1圈。向上平移0.54nm,即每個氨基酸殘基沿軸上升0.15nm。α-螺旋體中氨基酸殘基側(cè)鏈伸向外側(cè)，相鄰螺旋之間形成氫鍵，氫鍵方向與中心軸平行。分左手螺旋和右手螺旋。33當(dāng)前第33頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)34當(dāng)前第34頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)α-螺旋35當(dāng)前第35頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)β-折疊

肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈＞C＝O和＞N－H形成的氫鍵維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。平行排列：所有肽鏈的N端處于同一側(cè)，是同方向的。反向平行：肽鏈的N端一順一倒排列。反向平行結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。36當(dāng)前第36頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)紅球代表O原子;白球代表N原子紫色球代表R側(cè)鏈；37當(dāng)前第37頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)紅球代表O原子;白球代表N原子；紫色球代表R側(cè)鏈38當(dāng)前第38頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)39當(dāng)前第39頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)β-轉(zhuǎn)角多肽鏈中180度回折，第一個AA殘基的＞C＝O和第四個AA殘基的＞N－H形成的氫鍵40當(dāng)前第40頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)自由回轉(zhuǎn)無規(guī)則卷曲,沒有一定規(guī)律的松散結(jié)構(gòu),酶的功能部位常常處于這種構(gòu)象區(qū)域里。41當(dāng)前第41頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2.超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)：若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元,形成二級結(jié)構(gòu)組合體。例如，βαβ，βββ，αα，ββ等。42當(dāng)前第42頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)43當(dāng)前第43頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)44當(dāng)前第44頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)45當(dāng)前第45頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)結(jié)構(gòu)域多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步卷曲折疊成緊密的近似球狀的結(jié)構(gòu)。對較小蛋白質(zhì)分子，結(jié)構(gòu)域往往就是三級結(jié)構(gòu)，即這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域。許多蛋白質(zhì)是多結(jié)構(gòu)域。46當(dāng)前第46頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)結(jié)構(gòu)域47當(dāng)前第47頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)3.蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)多肽鏈的某些區(qū)域氨基酸形成二級結(jié)構(gòu):α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲等構(gòu)象單元,然后相鄰二級結(jié)構(gòu)集裝成超二級結(jié)構(gòu),進(jìn)而折疊繞曲成結(jié)構(gòu)域,由2個或2個以上的結(jié)構(gòu)域組裝成三級結(jié)構(gòu)。如肌紅蛋白。48當(dāng)前第48頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)4.蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)一個蛋白質(zhì)由幾條多肽鏈組成1個活性單位。亞基的相互關(guān)系，空間排布，亞基間通過非共價鍵聚合成的特定構(gòu)象。單一亞基無活性，只有聚合后才有生物活性。如血紅蛋白。49當(dāng)前第49頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)50當(dāng)前第50頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)蛋白質(zhì)預(yù)測網(wǎng)站

ComputepI/WMPredictproteinSOPMAUnpredict51當(dāng)前第51頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)蛋白質(zhì)信息資源（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB)

北大生物信息學(xué)中心

52當(dāng)前第52頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)MKRSKRFAVLAQRPVNQDGLIGEWPEEGLIAMDSPFDPVSSVKVDNGLIVELDGKRRDQF

DMIDRFIADYAINVERTEQAMRLEAVEIARMLVDIHVSREEIIAITTAITPAKAVEVMAQ

MNVVEMMMALQKMRARRTPSNQCHVTNLKDNPVQIAADAAEAGIRGFSEQETTVGIARYA

PFNALALLVGSQCGRPGVLTQCSVEEATELELGMRGLTSYAETVSVYGTEAVFTDGDDTP

WSKAFLASAYASRGLKMRYTSGTGSEALMGYSESKSMLYLESRCIFITKGAGVQGLQNGA

VSCIGMTGAVPSGIRAVLAENLIASMLDLEVASANDQTFSHSDIRRTARTLMQMLPGTDF

IFSGYSAVPNYDNMFAGSNFDAEDFDDYNILQRDLMVDGGLRPVTEAETIAIRQKAARAI

QAVFRELGLPPIADEEVEAATYAHGSNEMPPRNVVEDLSAVEEMMKRNITGLDIVGALSR

SGFEDIASNILNMLRQRVTGDYLQTSAILDRQFEVVSAVNDINDYQGPGTGYRISAERWA

EIKNIPGVVQPDTIEMPHGAILKELIAGVEEEGLHARVVRILRTSDVSFMAWDAANLSGS

GIGIGIQSKGTTVIHQRDLLPLSNLELFSQAPLLTLETYRQIGKNAARYARKESPSPVPV

VNDQMVRPKFMAKAALFHIKETKHVVQDAEPVTLHIDLVREMSEKTMRVQDYPLATRCPE

HILTPTGKPLTDITLEKVLSGEVGPQDVRISRQTLEYQAQIAEQMQRHAVARNFRRAAEL

IAIPDERILAIYNALRPFRSSQAELLAIADELEHTWHATVNAAFVRESAEVYQQRHKLRK

GS

等電點(diǎn)/分子量理論值:5.26/92840.80

舉例--甘油脫水酶的3個亞基序列53當(dāng)前第53頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)DeducedsecondarystructureoffusionproteindhaB123Alphahelix(Hh):399is47.39%310helix(Gg):0is0.00%Pihelix(Ii):0is0.00%Betabridge(Bb):0is0.00%Extendedstrand(Ee):125is14.85%Betaturn(Tt):76is9.03%Bendregion(Ss):0is0.00%Randomcoil(Cc):242is28.74%Ambigousstates(?):0is0.00%Otherstates:0is0.00

54當(dāng)前第54頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Green:αsubunitYellow:theactivesiteCyan:βsubunitGray:γsubunitMagenta:B12molecule

甘油脫水酶空間結(jié)構(gòu)55當(dāng)前第55頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（三）蛋白質(zhì)分子中的共價鍵與次級鍵共價鍵：肽鍵、二硫鍵次級鍵：氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、范德華力。56當(dāng)前第56頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)五、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系種屬差異分子?。ǘ┑鞍踪|(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系別構(gòu)現(xiàn)象（變構(gòu)效應(yīng)）：蛋白質(zhì)表現(xiàn)其功能時構(gòu)象發(fā)生變化。57當(dāng)前第57頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)58當(dāng)前第58頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)六、蛋白質(zhì)的性質(zhì)（一）蛋白質(zhì)的相對分子量（二）蛋白質(zhì)的兩性解離及等電點(diǎn)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：溶液在某一pH值時，蛋白質(zhì)所帶正電荷與負(fù)電荷相等，在電場中，蛋白質(zhì)分子既不向正極也不向負(fù)極移動。此時溶液的pH值稱為蛋白質(zhì)等電點(diǎn)。59當(dāng)前第59頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳的方向取決于所帶電荷的正負(fù)性、所帶電荷的多少、及分子顆粒大小。聚丙烯酰胺凝膠電泳60當(dāng)前第60頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)掩蓋了其他因素，電泳時只與分子量有關(guān)61當(dāng)前第61頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)SDS62當(dāng)前第62頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)SDS63當(dāng)前第63頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）64當(dāng)前第64頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Comparisonoffluorescentlabelled2-DgelwithsilverstainingCyTM5labelledgelSilverstainedgelE.colilysate,50gloading,pH4-765當(dāng)前第65頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（三）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)透析法：小分子可以通過半透膜，而蛋白質(zhì)不能，從而達(dá)到分離純化的目的。蛋白質(zhì)分子表面分布著許多極性和非極性基團(tuán)，非極性基團(tuán)與脂溶性物質(zhì)結(jié)合。而極性基團(tuán)與水溶性物質(zhì)結(jié)合形成水化層，水化層使蛋白質(zhì)顆粒相互排斥，不會凝結(jié)沉淀。66當(dāng)前第66頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（四）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)加高濃度鹽類：破壞水膜加有機(jī)溶劑：破壞水膜加重金屬鹽：蛋白質(zhì)與重金屬離子生成不易溶解的鹽而沉淀。67當(dāng)前第67頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（五）蛋白質(zhì)的變性因受物理或化學(xué)因素的影響，蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)都有所改變，但一級結(jié)構(gòu)不變。68當(dāng)前第68頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（六）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)：米倫氏反應(yīng)：乙醛酸反應(yīng)：坂口反應(yīng)：酚試劑反應(yīng)：69當(dāng)前第69頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)七、蛋白質(zhì)的分類簡單蛋白質(zhì)：只由α-氨基酸組成結(jié)合蛋白質(zhì)：簡單蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)部分（輔基）核蛋白：核酸+蛋白質(zhì)糖蛋白與蛋白聚糖脂蛋白：脂類+蛋白質(zhì)色蛋白：色素+蛋白質(zhì)磷蛋白：磷酸+蛋白質(zhì)70當(dāng)前第70頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)名人傳記王應(yīng)睞71當(dāng)前第71頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)王應(yīng)睞研究員,曾任中國科學(xué)院上海

分院院長，中科院上海生化所所長，比利時、匈牙利、捷克等國科學(xué)院名譽(yù)院士，1955年被選為中國科學(xué)院學(xué)部委員(院士)。王應(yīng)睞院士是我國著名的生物化學(xué)家、近代生物化學(xué)科研事業(yè)的主要奠基人。首次證明豆科植物中含血紅蛋白。成功地組織了人工合成結(jié)晶牛胰島素與酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸兩項重大基礎(chǔ)性研究工作。1996年獲香港何梁何利基金科學(xué)技術(shù)成就獎。72當(dāng)前第72頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)名人傳記鄒承魯鄒承魯,1923年生,江蘇無錫人。1951年獲劍橋大學(xué)博士。中國科學(xué)院院士，第三世界科學(xué)院院士,生物物理所研究員。曾任中科院生物學(xué)部主任,全國政協(xié)委員、常委,中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會理事長。在國內(nèi)外發(fā)表科學(xué)論文二百余篇。由于在胰島素人工合成，蛋白質(zhì)和酶學(xué)方面的貢獻(xiàn)，曾獲第三世界科學(xué)院獎、陳嘉庚生命科學(xué)獎、國家自然科學(xué)及中科院自然科學(xué)獎多次。自傳在國外出版的綜合生物化學(xué)叢書·生物化學(xué)史卷發(fā)表,對當(dāng)代生物化學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)已載入史冊。73當(dāng)前第73頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)鄒承魯照片74當(dāng)前第74頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)鄒承魯簡歷：由王應(yīng)睞教授介紹去劍橋大學(xué)師從Keilin教授第一篇論文1949年在英國Nature雜志上發(fā)表，導(dǎo)師Keilin教授不署名1951年回國，在中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所建立了研究組參與結(jié)晶牛胰島素的人工全合成1970年由上海調(diào)到北京生物物理所工作75當(dāng)前第75頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)科學(xué)家的境界追求心無旁騖，割席斷交

管寧、華歆共園中鋤菜，見地有片金，管揮鋤與瓦石不異，華捉而擲之去。

又嘗同席讀書，有乘軒冕過門者，寧讀如故，歆廢書出看。寧割席分坐曰：子非吾友也。

76當(dāng)前第76頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)小結(jié)重要概念：等電點(diǎn)肽健肽平面α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角超二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域別構(gòu)現(xiàn)象結(jié)合蛋白鹽析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)：一級結(jié)構(gòu)→二級結(jié)構(gòu)→超二級結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級結(jié)構(gòu)→四級結(jié)構(gòu)有關(guān)蛋白質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)蛋白質(zhì)的分離提純77當(dāng)前第77頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)第二節(jié)蛋白質(zhì)生物合成78當(dāng)前第78頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)遺傳密碼79當(dāng)前第79頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)蛋白質(zhì)合成概述DNA:ATGCATGCATGCRNA:AUGCAUGCAUGCProtein:aa1aa2aa3aa4堿基序列決定氨基酸序列如何實現(xiàn)堿基序列到氨基酸序列的轉(zhuǎn)變？80當(dāng)前第80頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)TACTTTAAAGTATranscription-TheProductionofmRNARNAPolymerasebeginstowork!!StartHere!!AUUGGAAAAAAAStopHere!!81當(dāng)前第81頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)TACTTTAAAGTA82當(dāng)前第82頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)mRNAmovesoutofthenucleustoRoughEndoplasmicReticulumRoughERNuclearMembraneRibosomesmRNA83當(dāng)前第83頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)AAAGUATranslation-ProteinSynthesisCodonCodonUUUtRNAAntiCodonUACtRNAMethionineUUUtRNAPhenylalanine84當(dāng)前第84頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Polypeptideformationviapeptidebonds.Translation-ProteinSynthesisRibosome(s)movealongmRNA.tRNAcarriersaminoacidsforbuildingpolypeptide.tRNAdropsawayfromribosome/mRNAonceamino-aciditcarriesisjoinedontothegrowingpolypeptideviapeptidebonds.85當(dāng)前第85頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Primary,Secondary,TertiaryandQuaternaryStructure-ProteinSynthesisPrimarySecondaryTertiaryUnfoldedsinglepolypeptidestrandFoldedsinglepolypeptidestrand-Secondary&TertiarySeveralpolypeptidestrandsQuaternary86當(dāng)前第86頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Translation-bigpictureInitiation:RecruitfMet-tRNAMet,mRNA,largeparticleElongation:SynthesizeproteinTermination:Stopsynthesis,releaseprotein87當(dāng)前第87頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)一、mRNAmRNA概念最初由F.Jacob和J.Monod1965年提出．當(dāng)時推測，有一種信使在細(xì)胞核中合成后攜帶上遺傳信息進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，后來發(fā)現(xiàn)，除rRNA和tRNA之外的第三種RNA，稱為信使RNA(mRNA)。mRNA半衰期很短,一旦完成使命就被水解。原核生物和真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)差異較大，尤其是在5’端。88當(dāng)前第88頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)

（一）原核生物mRNA的結(jié)構(gòu)

1、

5’端SD序列在起始密碼子AUG上游9-13個核苷酸處，有一段可與核糖體16SrRNA配對結(jié)合的、富含嘌呤的3-9個核苷酸序列，一般為AGGA，此序列稱SD序列。它與核糖體小亞基內(nèi)16SrRNA的3’端一段富含嘧啶的序列GAUCACCUCCUUA-OH（暫稱反SD序列）互補(bǔ)，形成氫鍵。使得結(jié)合于30S亞基上的起始tRNA能正確地定位于mRNA的起始密碼子AUG。89當(dāng)前第89頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Ribosomebindingsite(RBS)orSD-sequenceinprokaryoticmRNA,complementarywiththesequenceatthe3’endof16SrRNA.structureofmRNA90當(dāng)前第90頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2、原核mRNA轉(zhuǎn)譯時，各個基因都有自己的SD序列、起始密碼子、終止密碼子，分別控制其合成的起始與終止，換言之，每個基因的翻譯都是相對獨(dú)立的。如E.coli，一個7000b的mRNA編碼5種與Trp合成有關(guān)的酶多基因共表達(dá)載體構(gòu)建時，可利用SD序列，將幾個基因串聯(lián)91當(dāng)前第91頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（二）

真核生物mRNA的結(jié)構(gòu)1、真核生物mRNA5’端均具有m7GpppN帽子結(jié)構(gòu)，無SD序列。帽子結(jié)構(gòu)具有增強(qiáng)翻譯的作用。若起始AUG與帽子結(jié)構(gòu)間的距離太近（小于12個核苷酸），就不能有效利用這個AUG，會從下游適當(dāng)?shù)腁UG起始翻譯。當(dāng)距離在17-80個核苷酸之間時，離體翻譯效率與距離成正比。92當(dāng)前第92頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2、真核生物mRNA通常是單順反子。

真核mRNA具有“第一AUG規(guī)律”，即當(dāng)5’端具有數(shù)個AUG時，只有1個AUG為主要開放閱讀框架的翻譯起點(diǎn)。起始AUG具有2個特點(diǎn)：（i）AUG上游的-3經(jīng)常是嘌呤，尤其是A。（ii）緊跟AUG的+4常常是G。起始AUG鄰近序列中，以ANNAUGGN的頻率最高。若-3不是A，則+4必須是G。無此規(guī)律的AUG，則無起始功能。93當(dāng)前第93頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)OnceKozaksequenceEukaryoticmRNAusesamethylatedcaptorecruittheribosome.Oncebound,theribosomescansthemRNAina5’-3’directiontofindtheAUGstartcodon.Kozaksequenceincreasesthetranslationefficiency.Poly-Ainthe3’endpromotestheefficientrecyclingofribosomes9494當(dāng)前第94頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)KOZAK是一個女科學(xué)家

她研究過起始密碼子ATG周邊堿基定點(diǎn)突變后對轉(zhuǎn)錄和翻譯所造成的影響，并總結(jié)出在真核生物中，起始密碼子兩端序列為：——G/N-C/N-C/N-ANNATGG——，如GCCACCATGG、GCCATGATGG時，轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高，特別是-3位的A對翻譯效率非常重要。關(guān)于kozak序列的這篇文章發(fā)表在NucleicAcidsRes.1984上，該序列被后人稱為Kozak序列，并被應(yīng)用于表達(dá)載體構(gòu)建

95當(dāng)前第95頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)二、遺傳密碼氨基酸排列順序由mRNA的核苷酸順序決定。如果每2個核苷酸編碼1個氨基酸,那么4種核苷酸只有16種編碼方式。如果每3個核苷酸編碼1個氨基酸,則有64種編碼方式,。如果4對1則有256種,顯然沒必要?？茖W(xué)家們已用生物化學(xué)實驗證實3個堿基編碼1個氨基酸,稱為三聯(lián)體密碼或密碼子。96當(dāng)前第96頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（一）遺傳密碼的破譯美國科學(xué)家等人破譯了遺傳密碼,于1968年獲得諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎.早在1961年，等人在大腸桿菌的無細(xì)胞體系中外加poly(U)模板、20種標(biāo)記的氨基酸，經(jīng)保溫后得到了多聚phe-phe-phe，于是推測UUU編碼phe。利用同樣的方法得到CCC編碼pro，GGG編碼gly，AAA編碼lys。如果利用poly（UC），則得到多聚Ser-Leu-Ser-Leu，推測UCU編碼Ser，CUC編碼Leu，因為poly（UC）有兩種讀碼方式：UCU——CUC和CUC——UCU采用該方式，到1965年就全部破譯了64組密碼子。97當(dāng)前第97頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（二）遺傳密碼的特點(diǎn)在64個密碼子中有61個編碼氨基酸，3個不編碼任何氨基酸而起肽鏈合成的終止作用，稱為終止密碼子，它們是UAG、UAA、UGA，密碼子AUG（編碼Met）又稱起始密碼子。（編碼鏈上則為TAG、TAA、TGA、ATG）密碼子：mRNA上由三個相鄰的核苷酸組成一個密碼子，代表肽鏈合成中的某種氨基酸或合成的起始與終止信號。（1）方向性：從mRNA的5’到3’98當(dāng)前第98頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（2）連讀性從起始密碼子到終止密碼子構(gòu)成一個連續(xù)的閱讀框架（ORF）（不包括終止密碼子）。如果在閱讀框中插入或刪除一個堿基就會使其后的讀碼發(fā)生移碼。兩個基因之間或兩個ORF之間可能會互相部分重疊（共用部分序列）。（3）簡并性幾種密碼子編碼同一種氨基酸稱為密碼子簡并性。如GGN（GGA、GGU、GGG、GGC）都編碼Gly，這4種密碼子稱為Gly的簡并密碼。只有Met和Trp沒有簡并密碼。一般情況下密碼子簡并性只涉及第三位堿基。99當(dāng)前第99頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)問題：簡并性的生物學(xué)意義？可以降低由于遺傳密碼突變造成的物種災(zāi)難試想，如果每種氨基酸只有1個密碼子，如果一旦哪個氨基酸的密碼子發(fā)生了單堿基的點(diǎn)突變，那么極有可能造成肽鏈合成的過早終止。例如，由于簡并性的存在，不論第三位的U變成什么，都仍然編碼Ala100當(dāng)前第100頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（4）搖擺性密碼子中第3位堿基與反密碼子第1位堿基配對不一定完全遵循A-U、G-C的原則，即密碼子的第1、2位是嚴(yán)謹(jǐn)配對的，第3位嚴(yán)謹(jǐn)度低。密碼子第3位和反密碼子的第1位是搖擺位點(diǎn)，Crick稱之為搖擺性。反密碼子第1位的G可以與密碼子第3位的C、U配對，U可以與A、G配對，另外反密碼子中還經(jīng)常出現(xiàn)罕見的I，可以和密碼子的U、C、A配對，這使得該類反密碼子的閱讀能力更強(qiáng)。101當(dāng)前第101頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)102當(dāng)前第102頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)

問題：細(xì)胞內(nèi)有幾種tRNA？遺傳密碼破譯后，由于有61個密碼子編碼氨基酸，于是預(yù)測細(xì)胞內(nèi)有61種tRNA，但事實上絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)只有50種左右，Crick提出的搖擺假說合理解釋了這種情況。根據(jù)搖擺性和61個密碼子，經(jīng)過仔細(xì)計算，要翻譯61個密碼子至少需要31種tRNA，外加1個起始tRNA，共需32種。但在葉綠體和線粒體內(nèi)，由于基因組很小，密碼子少，葉綠體內(nèi)就有30種左右tRNAs，線粒體只有24種。（5）通用性：密碼子在不同物種間幾乎是完全通用的。目前只發(fā)現(xiàn)線粒體和葉綠體內(nèi)有例外情況。但是不同生物往往偏愛某一種密碼子。103當(dāng)前第103頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)三、

核糖體核糖體又稱核蛋白體，是蛋白質(zhì)合成場所.標(biāo)記各種氨基酸，注入大鼠體內(nèi)，在不同時間取出肝臟，勻漿，離心分離各種亞細(xì)胞器，分析放射性蛋白的分布，證實蛋白質(zhì)合成在核糖體上進(jìn)行。就真核細(xì)胞而言，核糖體按其在細(xì)胞質(zhì)中的位置分為游離核糖體（合成細(xì)胞質(zhì)蛋白）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體（合成分泌蛋白和細(xì)胞器蛋白）。104當(dāng)前第104頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)105當(dāng)前第105頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)

不論原核細(xì)胞還是真核細(xì)胞，一條mRNA可以同時被幾個核糖體閱讀，把同時結(jié)合并翻譯同一條mRNA的多個核糖體稱為多核糖體。106當(dāng)前第106頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)107當(dāng)前第107頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（一）核糖體的結(jié)構(gòu)與組成（2009年諾貝爾化學(xué)獎）核糖體是由核糖核酸（rRNA）和幾十種蛋白質(zhì)（核糖體蛋白）組成的巨大復(fù)合體。不同生物中核糖體的結(jié)構(gòu)高度保守，盡管其rRNA和核糖體蛋白的一級結(jié)構(gòu)有所不同，但其三級結(jié)構(gòu)卻驚人相似。核糖體是核酸和蛋白密切合作的體現(xiàn)！108當(dāng)前第108頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)每個核糖體是由大小兩個亞基組成，每個亞基都有各自不同的rRNA和蛋白質(zhì)分子核糖體的大亞基上有兩個重要的位點(diǎn)：P位點(diǎn)是結(jié)合肽酰tRNA的肽酰基的位點(diǎn)，A位點(diǎn)是結(jié)合氨酰tRNA的氨?；奈稽c(diǎn)。109當(dāng)前第109頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（二）rRNA與核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能1、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)：有大量莖環(huán)（發(fā)夾）結(jié)構(gòu)，可能是核糖體的鋼筋骨架。功能：（1）蛋白質(zhì)合成的施工平臺（2）參與tRNA與mRNA的結(jié)合

mRNA先識別rRNA的特定序列并結(jié)合固定,然后tRNA再識別并固定到rRNA特定部位，其反密碼子才與mRNA密碼子配對。已知16SrRNA上有一段序列與原核mRNA上的SD序列相結(jié)合。110當(dāng)前第110頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（3）在大小亞基的聚合中起作用（4）在翻譯的校正和調(diào)控方面有重要功能（如可結(jié)合調(diào)控因子）總的來說，RNA分子似乎是整個核糖體的活性中心。111當(dāng)前第111頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2、

核糖體蛋白的結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)：大多數(shù)核糖體蛋白呈纖維狀（可能起骨架作用），少數(shù)呈球狀（可能起生物功能）。功能：(1)維持核糖體的結(jié)構(gòu)(2)一些核糖體蛋白具有DNA結(jié)構(gòu)（Heilix—turn—Heilix模塊）；還有些真核核糖體蛋白具有DNA修復(fù)功能112當(dāng)前第112頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)四、蛋白質(zhì)合成的機(jī)理真核和原核生物在蛋白質(zhì)合成方面有共同之處,以下為蛋白質(zhì)合成的一般過程。游離氨基酸在摻入肽鏈前須先活化以獲得能量，每一種游離氨基酸須在專一的氨酰tRNA合成酶作用下與專一的tRNA相連（稱為裝載），然后由tRNA將它帶至核糖體的特定位點(diǎn)（A位點(diǎn)）并添加到正在合成的肽鏈C端。這種從游離氨基酸到形成氨酰tRNA的過程是氨基酸活化過程。113當(dāng)前第113頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（一）氨酰tRNA合成酶：氨基酸活化和氨酰tRNA合成是蛋白質(zhì)合成的第一步，由氨酰tRNA合成酶催化，該酶既能識別氨基酸，又能識別tRNA。1、活化在Mg2+存在下，氨酰tRNA合成酶首先識別并結(jié)合專一的配體氨基酸，然后氨基酸的羧基與ATP發(fā)生反應(yīng)形成一個酸酐型的高能復(fù)合物（氨酰AMP中間復(fù)合物），該中間復(fù)合物暫時結(jié)合在酶上。

酶/Mg2+氨基酸+ATP→氨酰AMP-酶+PPi114當(dāng)前第114頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)AMP115當(dāng)前第115頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2、連接氨酰tRNA合成酶有專一的tRNA識別位點(diǎn)，因此游離tRNA就會識別并結(jié)合到氨酰AMP-酶復(fù)合物的活性部位，氨基酸被轉(zhuǎn)移到tRNA的3端，其羧基與tRNA3端的自由-OH形成氨酰酯鍵，從而形成氨酰tRNA，此為高能化合物，其能量足以形成肽鍵。由于氨酰tRNA能量低于氨酰AMP，所以這一過程是自發(fā)的。

tRNA

+氨酰AMP-酶→氨酰tRNA+AMP+酶

116116當(dāng)前第116頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)aa-tRNAsynthase117當(dāng)前第117頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)ComplexofClassITyr-tRNAsynthetasewithtRNAtyr

Fig.Interactionsbetweentyrosyl-tRNAsynthetaseandtRNAtyr.(A)TheC-terminaldomain(orange)bindsintheelbowbetweenthelongvariablearmandtheanti-codonstemofthetRNA(redbackbone,greenbases).Theanti-codonstemloopinteractswithboththeC-terminaldomainandthe-helicaldomain(pink).ThetRNAmakesnocontactwiththecatalyticdomainofthesamesubunit(cyan).(B)Theunusualconformationoftheanti-codontripletinwhichAde-36isstackedonGua-34,whilePsu-35bulgesout.(C)Base-specificinteractionsofAsp-259fromthe-helicaldomainwithGua-34andAsp-423fromtheC-terminaldomainwithPsu-35.118當(dāng)前第118頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)mRNA119當(dāng)前第119頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)氨酰tRNA的去向由tRNA來決定，tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上密碼子相識別。結(jié)論：（1）氨基酸的活化和氨酰tRNA的合成是蛋白質(zhì)生物合成的第一步，活化和連接都發(fā)生在氨基酸的羧基上。（2）載體tRNA憑借自身的反密碼子與mRNA上的密碼子識別而把所攜帶的氨基酸送到肽鏈的一定位置上（3）遺傳信息是通過mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子間堿基配對作用而傳遞。120當(dāng)前第120頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)氨酰tRNA合成酶：氨酰tRNA合成酶既能識別氨基酸，又能識別tRNA，從而使氨基酸與tRNA相對應(yīng)，故把氨酰tRNA合成酶的雙向識別功能稱為第二遺傳密碼。121當(dāng)前第121頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)

不同氨酰tRNA合成酶在分子量、氨基酸序列、亞基組成上差異較大。其識別氨基酸的機(jī)理尚不太清楚。一些氨基酸結(jié)構(gòu)極其相似，盡管Ile與Val僅差一個甲基,但tRNAIle合成酶也能正確識別。偶爾也錯誤形成Val–tRNAIle，但是氨酰-tRNA合成酶都有一個校正位點(diǎn)，由于大小原因，只有Val–tRNAIle才能結(jié)合到校正位點(diǎn)，然后合成酶將Val又從tRNAIle上將其水解下來。122當(dāng)前第122頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)氨酰tRNA合成酶能正確識別和結(jié)合tRNA，一些氨酰tRNA合成酶識別tRNA上的反密碼子，以及tRNA上的受體莖環(huán)（acceptorstem）。tRNA分子的突變與校正基因tRNA是一個萬能接頭：（1）有氨酰-tRNA合成酶的識別位點(diǎn)（接頭合成酶）（2）3端-CCA上的氨基酸運(yùn)載位點(diǎn)（接頭氨基酸，裝載）（3）有核糖體的識別位點(diǎn)（將氨基酸運(yùn)送到目的地）（4）反密碼子位點(diǎn)（接頭mRNA，驗貨并卸載）123當(dāng)前第123頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)回復(fù)突變：突變型生物有時通過遺傳物質(zhì)的變化重新獲得其原有表型，被回復(fù)的生物稱為回復(fù)子?；貜?fù)突變的原因很多，有一種回復(fù)突變是其基因上發(fā)生一個突變而引起，稱為基因校正突變。大多數(shù)基因較正突變發(fā)生在tRNA基因上。124當(dāng)前第124頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)（二）蛋白質(zhì)合成的一般過程可以分為三個階段：起始、延伸、終止，分別由不同的起始因子、延伸因子和終止因子（釋放因子）參與。125當(dāng)前第125頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Fig14-14Overviewoftheeventsoftranslation/ribosomecycle126當(dāng)前第126頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)Polysome/polyribosome:anmRNAbearingmultipleribosomesEachmRNAcanbetranslatedsimultaneouslybymultipleribosomesFig14-15Apolyribosome127當(dāng)前第127頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)1、

翻譯起始（1）小亞基與mRNA結(jié)合（2）起始氨酰tRNA進(jìn)入P位點(diǎn)，其反密碼子與mRNA上的起始密碼子AUG堿基配對。（3）大亞基與小亞基結(jié)合形成起始復(fù)合物。128當(dāng)前第128頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)2、延伸方向：mRNA5/3/

新生肽：N/C/（1）就位：第二個氨酰tRNA通過密碼子—反密碼子的配對作用進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)（氨基位點(diǎn)）。（2）轉(zhuǎn)肽：在大亞基上肽酰轉(zhuǎn)移酶作用下，A位點(diǎn)氨基酸的α-氨基親核攻擊P位點(diǎn)上氨基酸的羧基并形成肽鍵，結(jié)果兩個氨基酸均連到A位點(diǎn)的tRNA上，該過程稱為轉(zhuǎn)肽作用，此時，P位點(diǎn)上卸載的tRNA從核糖體上離開。（3）移位（translocation）：核糖體沿著mRNA移動1個密碼子位置，tRNA移位到P位點(diǎn)，A位點(diǎn)空出以便接納下一個氨基酸。129當(dāng)前第129頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)3、

終止由于終止密碼子不能結(jié)合任何氨酰tRNA，于是終止因子（又稱釋放因子）識別并結(jié)合到終止密碼子上，接著肽轉(zhuǎn)移酶的酯化酶功能轉(zhuǎn)變成水解功能，將肽鏈從P位點(diǎn)tRNA上水解掉，核糖體釋放掉mRNA并解體成大小亞基，翻譯結(jié)束。在翻譯過程中除了核糖體大小亞基、mRNA和氨酰tRNA外，還需要GTP和許多蛋白輔助因子。這些輔助因子有的起催化作用，有的起改變和穩(wěn)定構(gòu)象作用。130當(dāng)前第130頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)4、翻譯后加工一些肽鏈翻譯完成后，能直接折疊成最終的活性形式，不需加工修飾。然而許多新生肽鏈需要翻譯后加工或修飾,包括：（1）切除部分肽段（蛋白酶），例如，酶原激活（2）在特定氨基酸殘基側(cè)鏈上添加基團(tuán)（共價修飾），例如糖基化、羥基化（3）插入輔因子，還有些單肽要聚合折疊成多亞基蛋白。131當(dāng)前第131頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)分子伴侶（MolecularChaperones）

定義：與新生肽鏈形成復(fù)合物并協(xié)助它正確折疊成具有生物功能構(gòu)象的蛋白質(zhì)，協(xié)助多肽鏈跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及多亞基蛋白質(zhì)的組裝和解體，但它不屬于新生肽鏈的組成部分。在原核表達(dá)時使用分子伴侶，減少包涵體的形成132當(dāng)前第132頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)包涵體-蛋白表達(dá)時的雙刃劍包涵體是指細(xì)菌表達(dá)的重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無活性、不溶性的固體顆粒。包涵體的存在常使得細(xì)胞破碎后很渾濁。

包涵體中一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等.

133當(dāng)前第133頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)包涵體的形成原因主要因為在重組蛋白的表達(dá)過程中缺乏某些蛋白質(zhì)折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等原因形成的。

1、表達(dá)量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)時很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達(dá)到足夠的溶解度等。

2、重組蛋白的氨基酸組成：一般說含硫氨基酸越多越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時容易形成包涵體。

4、重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達(dá)分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

134當(dāng)前第134頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)包涵體表達(dá)的有利因素1、可溶性蛋白在細(xì)胞內(nèi)容易受到蛋白酶的攻擊，包涵體表達(dá)可以避免蛋白酶對外源蛋白的降解。

2、降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。

3、包涵體中雜蛋白含量較低，且只需要簡單的低速離心就可以與可溶性蛋白分離，有利于分離純化。

4、對機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，并與細(xì)胞膜碎片分離。

135當(dāng)前第135頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)提高目的蛋白的可溶性的策略（1）在細(xì)胞中表達(dá)分子伴侶（天然或異源），輔助新生肽鏈折疊，避免

肽鏈相互聚合；

（2）共表達(dá)折疊酶，催化共價鍵形成；

（3）通過降低培養(yǎng)溫度和搖床速度來降低蛋白合成速度，以降低有聚

合傾向的中間體的濃度；

（4）選擇中等強(qiáng)度或低強(qiáng)度的啟動子代替強(qiáng)啟動子，降低重組蛋白的合

成速度；

（5）選擇適合的宿主菌株；

（6）表達(dá)含可溶性多肽或信號肽的重組蛋白，提高可溶性；

（7）蛋白質(zhì)的可溶性往往與自身的氨基酸序列有關(guān)，因此可利用誘突

技術(shù)改變其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性；

（8）誘導(dǎo)過程中加入化學(xué)物質(zhì)，以增加滲透壓或改變培養(yǎng)基的pH值。

136當(dāng)前第136頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)★在蛋白質(zhì)折疊中有兩類分子伴侶：（1）Hsp70s。Hsp70s是在折疊早期階段起作用的分子伴侶家族。大量的Hsp70s。大量的Hsp70s單體結(jié)合在未折疊的疏水的正延伸肽段上。每一個Hsp70s有兩個結(jié)合位點(diǎn)：未折疊多肽結(jié)合位點(diǎn)和ATP結(jié)合位點(diǎn)。多肽從Hsp70s上釋放需要能量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Hsp70s還是多肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)所必須的。（2）Hsp60s。一旦未折疊的多肽從Hsp70s上被釋放，它就結(jié)合到一些Hsp60s上（也稱chaparonins,cpn60s）。Hsp60s形成一個巨大的桶狀結(jié)構(gòu)，它有兩個蓋，未折疊蛋白進(jìn)入桶中，Hsp60s幫助它形成正確的結(jié)構(gòu)。分子伴侶還能幫助因各種脅迫而部分去折疊蛋白的重新折疊，如果不能重新折疊的話，分子伴侶就促進(jìn)它的降解。137當(dāng)前第137頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)138當(dāng)前第138頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)伴侶素GroEL/GroES系統(tǒng)促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊過程

伴侶素的主要作用——為非自發(fā)性折疊蛋白質(zhì)提供能折疊形成天然空間構(gòu)象的微環(huán)境。139當(dāng)前第139頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)分子伴侶的應(yīng)用及基礎(chǔ)研究文獻(xiàn)作用：促進(jìn)原核表達(dá)蛋白的可溶性LuciaBanci,etal.MolecularchaperonefunctionofMia40triggersconsecutiveinducedfoldingstepsofthesubstrateinmitochondrialproteinimport.PNAS,

2010,107:20190-20195StephanieMateriaetal.Clusterin(ApolipoproteinJ),aMolecularChaperoneThatFacilitatesDegradationoftheCopper-ATPasesATP7AandATP7B.J.Biol.Chem.,2011,286:10073-10083140當(dāng)前第140頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)翻譯后加工的目的：（1）功能需要（2）定向轉(zhuǎn)運(yùn)的需要（真核生物中尤為復(fù)雜，合成的蛋白要定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、各種細(xì)胞器如葉綠體、線粒體、溶酶體、過氧化物酶體等）。盡管原核生物與真核生物在蛋白質(zhì)合成方面有許多相似之處，但也存在差異，這些差異正是一些抗生素治療和研究應(yīng)用的基礎(chǔ)。

141當(dāng)前第141頁\共有147頁\編于星期五\17點(diǎn)非核糖體合成肽(NRP)MorganA.Wyatt,etal.

StaphylococcusaureusNonribosomalPeptideSecondaryMetabolit