常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用784

第二十二章常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication當(dāng)前第1頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第一節(jié)

分子雜交與印跡技術(shù)

MolecularHybridization&BlottingTechnology當(dāng)前第2頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)核酸分子雜交(nucleicacidhybridization)在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈(heteroduplex)

。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理當(dāng)前第3頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)復(fù)性RNADNA當(dāng)前第4頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)（一）印跡技術(shù)（二）探針技術(shù)

探針(probe)一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。

當(dāng)前第5頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。（二）RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

當(dāng)前第6頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)

其他斑點(diǎn)印跡(dotblotting)原位雜交(insituhybridization)DNA點(diǎn)陣(DNAarray)DNA芯片技術(shù)(DNAchip)當(dāng)前第7頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)三種印跡技術(shù)的比較當(dāng)前第8頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)③分子雜交實(shí)驗(yàn)①②目錄當(dāng)前第9頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)放射自顯影照片目錄當(dāng)前第10頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)DNA點(diǎn)陣目錄當(dāng)前第11頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第二節(jié)

聚合酶鏈反應(yīng)

PolymeraseChainReaction當(dāng)前第12頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目錄當(dāng)前第13頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。目錄當(dāng)前第14頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)模板DNA特異性引物耐熱DNA聚合酶dNTPsMg2+

二、PCR體系基本組成成分當(dāng)前第15頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)三、PCR的基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C當(dāng)前第16頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列測定（五）基因突變分析四、PCR的主要用途當(dāng)前第17頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)（一）反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（二）原位PCR技術(shù)（三）實(shí)時(shí)PCR技術(shù)當(dāng)前第18頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理目錄當(dāng)前第19頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第三節(jié)

核酸序列分析

NucleicAcidSequenceAnalysis當(dāng)前第20頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)核酸序列分析的基本原理化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)當(dāng)前第21頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)一、化學(xué)裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化學(xué)試劑可以使DNA鏈在1個(gè)或2個(gè)堿基處發(fā)生專一性斷裂的特性，精確地控制反應(yīng)強(qiáng)度，使一個(gè)斷裂點(diǎn)僅存在于少數(shù)分子中，不同分子在不同位點(diǎn)斷裂，從而獲得一系列大小不同的DNA片段，將這些片段經(jīng)電泳分離。分析前，用同位素標(biāo)記DNA的5′末端，經(jīng)放射自顯影即可在X膠片上讀出DNA鏈的序列。當(dāng)前第22頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)二、DNA鏈末端合成終止法當(dāng)前第23頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)目錄當(dāng)前第24頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)三、DNA自動測序采用熒光替代放射性核素標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)DNA序列分析自動化的基礎(chǔ)。用不同熒光分子標(biāo)記四種雙脫氧核苷酸，然后進(jìn)行Sanger測序反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳（平板電泳或毛細(xì)管電泳）分離后，通過四種激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子使之發(fā)射出四種不同波長熒光，檢測器采集熒光信號，并依此確定DNA堿基的排列順序。

當(dāng)前第25頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)DNA自動測序結(jié)果舉例目錄當(dāng)前第26頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)基因文庫

GeneLibrary第四節(jié)當(dāng)前第27頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)

基因文庫(genelibrary)是指一個(gè)包含了某一生物體全部DNA序列的克隆群體。當(dāng)前第28頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)目錄當(dāng)前第29頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第一輪篩選第二輪篩選第三輪篩選基因組文庫篩選結(jié)果舉例當(dāng)前第30頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)疾病相關(guān)基因的克隆與鑒定

CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五節(jié)當(dāng)前第31頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)克隆疾病相關(guān)基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候選基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候選基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)當(dāng)前第32頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)定義從對一種致病基因的功能的了解出發(fā)，克隆該致病基因。（一）功能性克隆應(yīng)用生化機(jī)制已明確、基因表達(dá)產(chǎn)物較易得到部分純化的遺傳性疾病。當(dāng)前第33頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)克隆方式

①利用特異性抗體篩選表達(dá)型cDNA文庫；②根據(jù)已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探針，篩選cDNA文庫。功能互補(bǔ)試驗(yàn)(functionalcomplementationassay)利用酵母系統(tǒng)從功能學(xué)角度鑒定致病基因。

當(dāng)前第34頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)（二）定位克隆定義從一種致病基因的染色體定位出發(fā)逐步縮小范圍，最后克隆該基因。系統(tǒng)的定位克隆工作①遺傳學(xué)分析(確定致病基因染色體定位)交換分析、連鎖不平衡分析②分子生物學(xué)分析染色體異常(缺失、易位等)分析、基因文庫的篩選與基因克隆當(dāng)前第35頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)（三）非定位候選基因克隆策略由于基因組作圖的完成和分子病理學(xué)的發(fā)展，人們可以不依靠染色體定位，直接根據(jù)病理學(xué)變化和對各種基因產(chǎn)物功能的了解，預(yù)測出候選致病基因。當(dāng)前第36頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)（四）定位候選基因克隆策略當(dāng)致病基因的染色體定位確認(rèn)后，人們可以利用因特網(wǎng)上的基因網(wǎng)站所提供基因序列數(shù)據(jù)，鑒定出候選致病基因。當(dāng)前第37頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第六節(jié)

遺傳修飾動物模型的建立及應(yīng)用TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel當(dāng)前第38頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因——被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)——目的基因的受體動物一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)當(dāng)前第39頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)核轉(zhuǎn)移技術(shù)

即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個(gè)體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體，即克隆(clone)。

二、核轉(zhuǎn)移技術(shù)當(dāng)前第40頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)目錄當(dāng)前第41頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)基因剔除技術(shù)也稱基因靶向(genetargeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。三、基因剔除技術(shù)當(dāng)前第42頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)四、基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用建立動物模型①單基因決定疾病模型

基因剔除獲得性突變(gain-of-functionmutation)②多基因決定疾病模型當(dāng)前第43頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第七節(jié)

生物芯片技術(shù)BiologicalChipTechnology當(dāng)前第44頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)DNA芯片(DNAchip)

cDNA芯片(cDNAchip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上

。一、基因芯片(genechip)當(dāng)前第45頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)目錄當(dāng)前第46頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點(diǎn)陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時(shí)，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進(jìn)行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(proteinchip)當(dāng)前第47頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)第八節(jié)蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

ResearchTechnologyofInteractionofProtein當(dāng)前第48頁\共有52頁\編于星期五\19點(diǎn)蛋白質(zhì)之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復(fù)合物是細(xì)胞各種基本功能的主要完成者。幾乎所有的重要生命活動，包括DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成與分泌、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝等等，都離不開蛋白質(zhì)之間的相互作用。蛋白質(zhì)之間相互作用研究的重要性當(dāng)前第49頁\共有52頁\