誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)與寄生蟲感染轉(zhuǎn)載自中國科技信息網(wǎng)一氧化氮(NO)在體內(nèi)由L一精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下生成。它是一種重要的信使分子，參與血管、氣道平滑肌的調(diào)節(jié)，神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，細(xì)胞殺傷，腫瘤細(xì)胞的溶解及內(nèi)分泌激素的釋放過程，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；既在機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)多種細(xì)胞中具有廣泛的生理功能，又可能參與多種疾病的發(fā)生過程。NOS是合成NO的唯一限速酶，寄生蟲感染時(shí)，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)由其誘發(fā)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，細(xì)胞因子激發(fā)一氧化氮合酶基因，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生iNOS(induciblenitricoxidesynthase)mRNA,由iNOSmRNA指導(dǎo)一氧化氮合酶生成。本文就NOS的類型和iNOS的表達(dá)及NO的生成和NO對寄生蟲的作用以及影響NO抗寄生蟲感染的因素做一簡要綜述。NOS的類型和iNOS的表達(dá)及NO的生成許多研究表明,NO是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使和新的神經(jīng)遞質(zhì)，又是效應(yīng)分子［1］。它介導(dǎo)并調(diào)節(jié)多種生理機(jī)制，在呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥和免疫反應(yīng)中起著重要的作用，但也導(dǎo)致病理生理狀態(tài)。由于NO可在數(shù)種哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，在體內(nèi)又具有廣泛的生理作用，因而這種化學(xué)結(jié)構(gòu)如此簡單的小分子被美國《Science》雜志評為1992年年度分子［2］。NOS根據(jù)所在組織類型，在細(xì)胞中的分布，效應(yīng)方式，組織表達(dá)，對Ca2+/鈣調(diào)蛋白的依賴性及對不同激動(dòng)劑的反應(yīng)，可分為以下3種類型［3］:I型:神經(jīng)型NOS(ncNOS)，首先于腦組織中發(fā)現(xiàn)，所產(chǎn)生的NO為神經(jīng)遞質(zhì)，也可能作為神經(jīng)和血管之間的間介物。為結(jié)構(gòu)表達(dá)。II型:可誘導(dǎo)型NOS(iNOS)，主要存在于單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、肝臟、平滑肌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，另外在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元中也有分布。為非結(jié)構(gòu)表達(dá)。III型:上皮型NOS(ecNOS)，存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞，與ncNOS類似，為結(jié)構(gòu)表達(dá)，對Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴，分布于胞漿中。在心臟、腸、腎、肝臟和腦等重要臟器的血流量調(diào)節(jié)以及血管舒張的局部信號機(jī)制中占有重要地位。目前普遍認(rèn)為，與抗寄生蟲感染密切相關(guān)的為iNOS，主要存在于M^中，也存在于中性粒細(xì)胞、神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞和肝細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)，細(xì)菌脂多糖(LPS)和多種細(xì)胞因子都可誘導(dǎo)其高水平表達(dá)iNOS。一旦被誘導(dǎo)，iNOS接著能在相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)以恒定的速度合成大量的NO。由此產(chǎn)生的NO能選擇性地作用于寄生蟲或寄生蟲感染的細(xì)胞，在局部或全身發(fā)揮抗寄生蟲作用［4］。Hibbs等［5?7］在1987年提出了NO的生化合成途徑：在此途徑中，細(xì)胞因子可由寄生蟲感染所致。楊志偉等［8］(1999)發(fā)現(xiàn)經(jīng)血吸蟲感染家兔，蟲卵肉芽腫周圍有iNOS和巨噬細(xì)胞強(qiáng)陽性反應(yīng)物，蟲卵肉芽腫周圍聚集有巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞，并有腫瘤壞死因子TNF—a和表皮生長因子EGF存在。龍小純、李雍龍等［9］對小鼠感染血吸蟲后不同時(shí)間的肝組織總RNA進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明，未感染血吸蟲的小鼠肝組織iNOS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)為陰性，感染后21d，肝組織出現(xiàn)iNOS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提示日木血吸蟲能誘導(dǎo)宿主肝組織iNOS的轉(zhuǎn)錄。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在肺內(nèi)特別是寄生蟲周圍的炎性組織中有高水平iNOSmRNA［10］，表達(dá)iNOS基因缺陷小鼠(iNOS-鼠)感染枯氏錐蟲后,其體內(nèi)NO的產(chǎn)生明顯減少,并減弱了殺錐蟲能力［11］。證實(shí)iNOS是合成NO的關(guān)鍵酶。NO抗寄生蟲感染的作用機(jī)制在寄生蟲感染中,NO一方面能殺死寄生蟲，起保護(hù)機(jī)體的作用，另一方面可能產(chǎn)生相反的作用。關(guān)于NO的抗寄生蟲作用的確切機(jī)制尚不清楚,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NO作用于寄生蟲的關(guān)鍵代謝酶，使其失活，而發(fā)揮抗寄生蟲的作用［12］。人們知道,NO與一般的生物效應(yīng)分子不同，其不需與特異性受體結(jié)合,因具有脂溶性，可直接進(jìn)入寄生蟲體內(nèi)發(fā)揮殺傷作用。NO抗寄生蟲感染的作用機(jī)制可能有二種，一種是NO與寄生蟲體內(nèi)多種代謝酶的活性部位Fe-S基團(tuán)結(jié)合形成鐵-亞硝酰基復(fù)合物，造成鐵離子的喪失和酶活性的抑制，致使能量的產(chǎn)生和DNA的合成受阻，從而干擾寄生蟲的生理代謝。NO抗寄生蟲作用的另一機(jī)制為通過與氧自由基作用。即NO與超氧陰離子(O2-)作用生成過氧亞硝酸根陰離子(ONOO-),ONOO-再與H+作用生成過氧化硝酸(ONOOH),ONOOH可分解成NO2-的氧自由基(?OH),ONOO-為強(qiáng)氧化劑,?OH為作用最強(qiáng)的氧自由基，導(dǎo)致硫基蛋白破壞，脂質(zhì)氧化,?OH還能與核酸反應(yīng)引起DNA鏈斷裂。NO通過以上途徑間接作用抑制和殺傷寄生蟲［13］。3NO抗寄生蟲作用3.1抗原蟲作用阿米巴原蟲對NO介導(dǎo)的殺傷作用敏感，有研究表明［14,15］,INF-y活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO可殺滅阿米巴原蟲,且此過程可被L一精氨酸競爭抑制劑(L-NMMA)抑制,而應(yīng)用INF-a增加巨噬細(xì)胞內(nèi)iNOSmRNA的表達(dá)，可加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對阿米巴原蟲的殺傷效果，提示NO介導(dǎo)的效應(yīng)機(jī)制在宿主抗阿米巴原蟲感染中起著重要的作用。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均已表明,IFN-Y等細(xì)胞因子活化的M^可抑制剛地弓形蟲速殖子的感染及其在細(xì)胞內(nèi)的培殖，而此作用歸咎于活化的M^內(nèi)源性誘導(dǎo)的NO。研究證明，活化的M^可分泌NO,其殺傷弓形蟲活力隨產(chǎn)量的升高而升高，并依賴于L一精氨酸［16］。L-NMMA可抑制M^殺傷弓形蟲的活力，而添加過量的L一精氨酸又可逆轉(zhuǎn)其殺傷活力和NO的產(chǎn)量，表明NO是活化M^抗弓形蟲作用的主要效應(yīng)分子［17］。牛宇欣等［18］也用體外方法研究了IFN-Y激活的巨噬細(xì)胞對約氏瘧原蟲(P.yoelii)的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞對約氏瘧原蟲的殺傷作用與其本身的NO釋放量呈顯著相關(guān)性(r=0.898)。NO合成抑制劑L-NA能明顯降低巨噬細(xì)胞的殺傷作用，給感染瘧原蟲的BALB/C小鼠注射L-NA后，其原蟲血癥上升，小鼠死亡率升高。提示由IFN-Y激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO可能是殺傷瘧原蟲的重要作用機(jī)制。3.2抗蠕蟲作用龍小純等［19］發(fā)現(xiàn)用LPS或LPS與IFN-Y活化小鼠腹腔分離的巨噬細(xì)胞，在離體條件下均能有效活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高濃度的NO,其對童蟲的殺蟲率可達(dá)90%以上。用抑制劑L-NNA處理巨噬細(xì)胞后，其對童蟲的細(xì)胞毒效應(yīng)明顯低于未經(jīng)抑制劑處理的對照組，進(jìn)一步證明了NO對日本血吸蟲童蟲的細(xì)胞毒作用。Kanazewa等(1993)研究表明，INF-Y或INF-Y和LPS活化的腹腔M^對多房棘球絳蟲的原頭蝴具有顯著的殺傷活性。培養(yǎng)液中加入L-NMMA可完全抑制活化M^的殺傷活性，而加入過量的L-精氨酸可恢復(fù)M^的殺傷活性。這些結(jié)果表明，活化的M^具有殺傷棘球絳蟲的原頭蝴的活性，提示活性氮介質(zhì)(reactivenitrogenintermediates,RNI)在這種殺傷機(jī)制中具有重要的作用。陳學(xué)昊等［20］研究NO在抗囊尾蝴免疫中的作用時(shí)，用Griees法和ELISA法檢測血清中NO水平和特異性IgG含量,發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期患者體內(nèi)NO水平明顯高于正常對照組,NO的生成量與疾病輕重呈正相關(guān)，蔡連順發(fā)現(xiàn)患者血清中IgG高于正常人,并得出了患者血清中NO生成量與IgG介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)的結(jié)論。表明NO參與抗囊尾蝴免疫發(fā)揮殺傷囊尾蝴作用。4影響NO抗寄生蟲感染的因素4.1細(xì)胞因子對NO抗寄生蟲感染的影響自從1976年第一屆細(xì)胞因子專題會(huì)議以后，對其研究更加活躍。細(xì)胞因子誘導(dǎo)一氧化氮酶的生成，故可影響NO的生成，從而影響NO對寄生蟲的作用。根據(jù)對NO的作用，細(xì)胞因子可分為兩類：一類是發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用如IFN-Y、TNFa、IL-l等，另一類發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用如IL—4、IL—10、TGF—8等［21］?？傊?，體內(nèi)NO的產(chǎn)生及抗寄生蟲作用是受細(xì)胞因子嚴(yán)格調(diào)節(jié)的。4.2對NO生成有關(guān)的物質(zhì)影響抗寄生蟲效果NOS抑制劑的使用，可以影響NO在寄生蟲感染中的作用。目前常用的NOS選擇性抑制劑有:①左旋精氨酸類似物，如N-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA),N-硝基-L-氨酸(L-NNA),N-基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)等,是iNOS競爭性抑制劑;②糖皮質(zhì)激素類，典型的免疫抑制藥物地塞米松、氫化可的松等，專一抑制iNOS的表達(dá)，對cNOS無抑制作用;③氨基胍(L-AG)是一種很強(qiáng)的NOS抑制劑，抑制作用大于精氨酸類似物,對iNOS的抑制程度大于對cNOS的抑制;④其他抑制劑如硫-甲基異硫脲(SMT)以及類似物,現(xiàn)已證明能特異性抑制iNOS;環(huán)抱霉素A為傳統(tǒng)的免疫抑制藥物,能有效地抑制iNOS基因表達(dá)和iNOS酶活性。放線菌素和環(huán)乙亞胺對iNOS的基因有調(diào)節(jié)作用［22］。研究表明巨噬細(xì)胞用抑制劑L-NNA處理后，分泌的NO對日本血吸蟲童蟲有細(xì)胞毒作用。4.3細(xì)菌脂多糖(LPS)對NO抗寄生蟲感染的影響細(xì)菌脂多糖(LPS)是一種內(nèi)毒素，其對NO的合成有一定作用。段慧琴等研究表明用內(nèi)毒素處理體外培養(yǎng)的腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞后，上清液的NO含量急劇增加，說明內(nèi)毒素可直接導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放NO。從LPS引起微血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO升高的程度來看，此試驗(yàn)川g/ml、5pg/ml和1Qpg/ml的LPS刺激腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞后,NO的分泌量在24h達(dá)到高峰,分泌量約為原來的3倍。這就表明LPS對NO的合成呈正向調(diào)節(jié)作用，從而加