生物芯片技術(shù)及其進(jìn)展

生物芯片技術(shù)及其進(jìn)展侯治富吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部中日聯(lián)誼醫(yī)院當(dāng)前第1頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)的主要內(nèi)容生物芯片的概念生物芯片的基本原理生物芯片的分類生物芯片的發(fā)展歷程生物芯片的技術(shù)方法生物芯片的應(yīng)用當(dāng)前第2頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片的定義生物芯片（Biochip或Bioarray）是指包被在固相載體上的高密度DNA、抗原、抗體、細(xì)胞或組織的微點(diǎn)陣(microarray）。生物芯片的種類：包括DNA芯片、抗原芯片、抗體芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片等。1998年世界十大科技突破之一。未來十年最具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)。當(dāng)前第3頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片的定義Bio：[詞素]生...，生物...;Chip：屑晶片,薄片;[電子]集成電路片;[英漢計(jì)算機(jī)名詞]芯片Array：陣,列,排列,配置,系,組,級(jí)數(shù),芯片當(dāng)前第4頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第5頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片的概念——集成當(dāng)前第6頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)12345678910111213141516171819202122XYOncogeneTargetsOntheAmpliOnc?IBiochipPDGFBEGFR1PDGFRAMETFGFR2WNT1MYBHER2YES1HRAS1CND1RAF1GLIMYCMDM220q13RELMYCL1FGRFESABLINT2PIK3CANMYCAKT2FGFR1JUNBAKT1KRAS2CDK4AR當(dāng)前第8頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片基本原理當(dāng)前第9頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第10頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第11頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片的特點(diǎn)高度并行性：提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對照和閱讀。多樣性：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高精確性，減少誤差。微型化：減少試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率。自動(dòng)化：降低成本，保證質(zhì)量。高通量當(dāng)前第12頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片的分類尚未統(tǒng)一。廣義上：矩陣型芯片、處理型芯片固化材料：基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片用途分類……當(dāng)前第13頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片研究的歷史1991Affymatrix公司StephenFodor:光刻與光化學(xué)技術(shù)、多肽和寡聚核苷酸微陣列。DNAChip概念Stanford大學(xué)Brown實(shí)驗(yàn)室：預(yù)先合成，機(jī)械手陣列1995Schena等：基因表達(dá)譜1996Cheeetal：DNA測序1996Croninetal：突變檢測1996Sapolsley&Lipshutz：基因圖克隆1996Shalonetal：復(fù)雜DNA樣本分析1996Shoemakeretal：缺省突變定量表型分析當(dāng)前第14頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第15頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)2014年化學(xué)諾獎(jiǎng)得主：埃里克·白茲格，斯特凡·W·赫爾和威廉姆·艾斯科·莫爾納爾。

這三位獲獎(jiǎng)理由是表彰他們在超分辨率熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域取得的成就。

當(dāng)前第16頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第17頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)分類（根據(jù)應(yīng)用）基因變異檢測芯片疾病檢測(如HIV、P53基因、結(jié)核桿菌)法醫(yī)鑒定(如DNA指紋圖譜)表達(dá)譜芯片腫瘤相關(guān)基因(正常與腫瘤組織表達(dá)差異)藥物篩選(培養(yǎng)細(xì)胞藥物刺激前后表達(dá)差異)發(fā)育(同一組織不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)差異)組織發(fā)生(不同組織或器官的基因表達(dá)差異)當(dāng)前第18頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)分類（根據(jù)工藝和載體）原位合成法：密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特異性較差，寡聚核苷酸合成長度有限，且隨長度增加，合成錯(cuò)誤率增高。成本較高，設(shè)計(jì)和制造較煩瑣費(fèi)時(shí)。DNA微矩陣法：成本低，易操作，點(diǎn)樣密度通常能滿足需要。芯片的載體需表面緊質(zhì)、光滑的固體，如硅，陶，玻璃等，DNA微矩陣芯片常用玻片為載體。當(dāng)前第19頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第20頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)分類（根據(jù)DNA成分）寡聚核苷酸或DNA片段：約2025個(gè)核苷酸堿基，常用于基因類型的分析，如突變、正常變異（多態(tài)性）。全部或部分cDNA：約5005000個(gè)核苷酸堿基，通常用于兩種或以上樣本的相關(guān)基因表達(dá)分析。當(dāng)前第21頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)ComparisonofDNAChipTechnologies

SensitivityofDNAchipbasedassaysisafunctionof:ProbeandtargetDNA/RNA(Complexity)Chipsurface(autofluorescence&non-spec.bkg)Attachmentchemistry/methodology(hyb.efficiency&crosshyb.)Hybridizationefficiency(lotsoffactors)Detectiontechnology(signaltype,efficiency,noise)

Oligo-Chip cDNA-Chip GenomicChip8nor20n<2,000n>50,000n sequencingexpressionexpressiongenomicanalysis當(dāng)前第22頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)基因芯片的種類ScienceChip：生物分析和診斷。NutriChip：食物分析、轉(zhuǎn)基因、污染檢測。LeukoChip：血液分析、病毒分析、HLA分析。AquaChip：水質(zhì)分析。SecureChip：含DNA的物質(zhì)鑒定。ChromoChip：基因分析和染色體序列。ProkaryoChip：原核生物、獸醫(yī)、環(huán)保等。當(dāng)前第23頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)主要環(huán)節(jié)芯片制備：微點(diǎn)陣樣本制備：DNA提純、擴(kuò)增、標(biāo)記雜交：樣本與互補(bǔ)模板形成雙鏈檢測：共聚焦掃描，雙色激光數(shù)據(jù)處理：定量軟件，數(shù)據(jù)庫檢索，RNA印跡等。結(jié)果分析……

當(dāng)前第24頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)細(xì)胞對mRNA進(jìn)行標(biāo)記雜交基因表達(dá)資料生物芯片的制作步驟

當(dāng)前第25頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片分析1、測定過程應(yīng)包括五個(gè)基本步驟：需解決的生物學(xué)問題樣本制備生物化學(xué)反應(yīng)檢測數(shù)據(jù)分析TumorSampleNormalSample當(dāng)前第26頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)2、生物學(xué)系統(tǒng)控制必須精確地與檢測目的相匹配。

3、生物學(xué)樣本必須精確地與生物學(xué)種類相匹配。

4、所有基因分析必須平行處理。

5、基因分析技術(shù)必須適合微型化和自動(dòng)化。

6、平行格式必須精確的依據(jù)生物學(xué)樣本的次序。

7、檢測系統(tǒng)必須能精確地獲得數(shù)據(jù)。

8、檢測系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)必須能被精確地控制和重復(fù)。當(dāng)前第27頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)9、兩種或以上平行數(shù)據(jù)組比較應(yīng)受到單

個(gè)實(shí)驗(yàn)所固有特性的限制。

10、絕對比例關(guān)系只存在于組合實(shí)驗(yàn)的平

行數(shù)據(jù)組內(nèi)。

11、平行格式包括內(nèi)在和外部的整個(gè)系統(tǒng)

誤差的分析因素。

12、在每個(gè)系統(tǒng)模塊中采集到該系統(tǒng)所有

變量的四維數(shù)據(jù)時(shí)，才能稱為完成生

物系統(tǒng)平行基因分析。

當(dāng)前第28頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)的12條原則只是一個(gè)基本框架。其術(shù)語的詳細(xì)定義和有關(guān)理論可參見

當(dāng)前第29頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)芯片制備原位合成法（insitusynthesis):又可分為原位光控合成法和原位標(biāo)準(zhǔn)試劑合成法。適用于寡核苷酸，使用光引導(dǎo)化學(xué)原位合成技術(shù)。是目前制造高密度寡核苷酸最為成功的方法。合成后交聯(lián)（post-syntheticattachment):利用手工或自動(dòng)點(diǎn)樣裝置將預(yù)先制備好的寡核苷酸或cDNA樣品點(diǎn)在經(jīng)特殊處理過的玻片或其他材料上。主要用于診斷、檢測病原體及其他特殊要求的中、低密度芯片的制備。當(dāng)前第30頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第31頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)兩種制備方法比較原位合成：測序、查明點(diǎn)突變高密度、根據(jù)已知的DNA編制程序制作復(fù)雜、價(jià)格昂貴、不能測定未知DNA序列合成后交聯(lián)：比較分析制備方式直接和簡單，點(diǎn)樣的樣品可事先純化，交聯(lián)方式多樣，可設(shè)計(jì)和制備符合自己需要的芯片。中、低密度，樣品浪費(fèi)較多且制備前需儲(chǔ)存大量樣品。當(dāng)前第32頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)雜交是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對規(guī)則形成雙鏈反應(yīng)。選擇雜交條件時(shí)，必須滿足檢測時(shí)的靈敏度和特異性。使能檢測到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交。合適長度的DNA有利于與探針雜交。溫度、非特異性本底等均會(huì)影響雜交結(jié)果。最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐。當(dāng)前第33頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)樣本制備制備高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的。制備細(xì)胞、組織或整個(gè)器官樣本應(yīng)特別小心。溫度、激素和營養(yǎng)環(huán)境、遺傳背景、組織成分等輕微改變都會(huì)使基因表達(dá)的結(jié)果發(fā)生明顯變化。用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達(dá)研究的樣本是cDNA。樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，通常為酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和核素標(biāo)記。當(dāng)前第34頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)結(jié)果分析

芯片與標(biāo)記的靶DNA或RNA雜交后，或與標(biāo)記的靶抗原或抗體結(jié)合后，可采用下列方法分析處理數(shù)據(jù)：共聚焦掃描儀：應(yīng)用最廣，重復(fù)性好但靈敏度較低。質(zhì)譜法：快速、精確，可準(zhǔn)確判斷是否存在基因突變和精確判斷突變基因的序列位置。探針合成較復(fù)雜?；瘜W(xué)發(fā)光、光導(dǎo)纖維、二極管方陣檢測、直接電荷變化檢測等。當(dāng)前第35頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)芯片掃讀裝置根據(jù)采用的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。根據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光型。應(yīng)用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應(yīng)用廣泛。當(dāng)前第36頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)圖象分析復(fù)雜的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成。分析軟件的功能：鑒定每個(gè)點(diǎn)陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標(biāo)記或排除假陽性、識(shí)別和分析對照實(shí)驗(yàn)是否成功、可將信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化等。圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。當(dāng)前第37頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)對照：體外轉(zhuǎn)錄從cDNA合成mRNA，參入標(biāo)本中作為對照。此mRNA不與點(diǎn)陣的核酸雜交。將不同濃度的不同基因參入標(biāo)本中，可作為標(biāo)本間標(biāo)準(zhǔn)化的參照。用兩種不同吸收光譜的熒光素同時(shí)分析兩個(gè)標(biāo)本，如果兩種熒光強(qiáng)度一致，可排除標(biāo)本間變異因素。用單一堿基錯(cuò)配的寡核苷酸做對照可排除交叉雜交。

當(dāng)前第38頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)結(jié)果有效性的證實(shí)在表達(dá)矩陣上，有時(shí)難于區(qū)分極其相似的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達(dá)水平時(shí)，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上DNA的長度都會(huì)影響雜交。證實(shí)矩陣分析的結(jié)果可用RT-PCR(區(qū)別基因族成員,比較不同DNA種系表達(dá),證實(shí)基因變異或突變和精確測定DNA表達(dá)水平)、NorthernBlot(證實(shí)某一基因的相對表達(dá)水平)、WesternBlot(RNA表達(dá)是否達(dá)到細(xì)胞中的蛋白水平)、質(zhì)譜儀(證實(shí)矩陣結(jié)果是否在蛋白水平)等。當(dāng)前第39頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)的應(yīng)用基因表達(dá)分析：腫瘤基因突變檢測：遺傳性疾病測序、基因圖繪制和多態(tài)性分析：測序微生物菌種鑒定：毒力基因、抗藥基因藥物研究：新藥篩選、指導(dǎo)合理用藥克隆選擇及文庫篩選當(dāng)前第40頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)的發(fā)展發(fā)展趨勢微型化：DNA矩陣越來越小。集成化：矩陣上的基因組越來越大。多樣化：測定范圍越來越廣。微量化：測定所需樣本越來越少。全自動(dòng)化：樣品制備到結(jié)果顯示全部分析過程。定量化：如激光捕獲技術(shù)，顯微解剖技術(shù)等可精確測定一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)基因的表達(dá)。DNA矩陣數(shù)據(jù)信息庫的完善。當(dāng)前第41頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片技術(shù)的發(fā)展技術(shù)毛細(xì)管電泳芯片技術(shù)PCR芯片技術(shù)(PCR-Chip)縮微芯片實(shí)驗(yàn)室(lab-on-a-chip)微珠芯片技術(shù)(beadArray)抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)(Antibodyandprotein-arraytechnology)自我定制芯片技術(shù)（makeyourownchip)血?dú)夥治鲂酒?dāng)前第42頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)毛細(xì)管電泳芯片技術(shù)Mathies最早報(bào)道毛細(xì)管電泳芯片測序結(jié)果，在10分鐘內(nèi)完成了對433個(gè)堿基序列的測定。賓夕法尼亞大學(xué)Wilding等成功地利用毛細(xì)管電泳芯片分離了用于診斷杜鑫-貝克肌萎縮的多條DNA片段。瑞士Ciba-Geigy公司和加拿大Alberta大學(xué)合作利用玻璃毛細(xì)管電泳芯片完成了對寡核苷酸的分離。當(dāng)前第43頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)縮微芯片實(shí)驗(yàn)室在一張芯片上完成樣品(如血液、組織等)制備、化學(xué)反應(yīng)、檢測和數(shù)據(jù)分析。1998年程京博士首次應(yīng)用LOC實(shí)現(xiàn)了從樣品制備到反應(yīng)結(jié)果顯示的全部過程，成果地從混有大腸桿菌的血清中分離出了細(xì)菌。含有加熱器、微泵微閥、微流量控制器、電子化學(xué)和電子發(fā)光探測器的芯片已經(jīng)問世。也已出現(xiàn)樣品制備、化學(xué)反應(yīng)和分析檢測部分結(jié)合的芯片。LOC與衛(wèi)星傳輸和網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)結(jié)合，將實(shí)現(xiàn)高通量、一體化和移動(dòng)性的“未來型掌上實(shí)驗(yàn)室”的構(gòu)想。當(dāng)前第44頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)(protiomics)的興起，促進(jìn)了抗體和蛋白質(zhì)陣列技術(shù)的發(fā)展。PareickBrown使用特異性抗體微矩陣，測定了細(xì)胞和體液樣本中數(shù)千種不同的蛋白質(zhì)。Leuking等采用蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)，測定了10pg的微量蛋白質(zhì)，并證實(shí)假陽性極低。當(dāng)前第45頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)乳腺癌基因芯片當(dāng)前第46頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)Stanford乳腺癌微矩陣(Perouetal.1999)每種基因的數(shù)據(jù)以行表示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)用列表示。顏色強(qiáng)度表示對照和實(shí)驗(yàn)cDNA的比率。比率相同時(shí)為1。結(jié)果為紅色表示mRNA增加，綠色表示減少，灰白色表示缺乏。兩種基因的相似性用Pearson相關(guān)公式或Euclidian測距公式計(jì)算。當(dāng)前第47頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)DNA微矩陣分析軟組織肉瘤表達(dá)

KavineMaillardetal(1999)cDNAs進(jìn)行DNA表達(dá)矩陣，PCR產(chǎn)物包被在經(jīng)賴氨酸處理的玻片上，用Cys3-和Cys5-標(biāo)記的cDNA進(jìn)行雜交，洗滌后用Scanarray3000掃描儀測定矩陣，表達(dá)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存在ACeDB數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)數(shù)據(jù)表達(dá)類型區(qū)分不同的基因。當(dāng)前第48頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)微矩陣分析DNA和蛋白表達(dá)

HolgerEickhoffetal.(1999)根據(jù)已有的序列數(shù)據(jù)，組合800000人類EST序列，已重矩陣了38000克隆用于RNA表達(dá)分析，克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增后共價(jià)結(jié)合于玻片上，每張玻片固定19200個(gè)基因片段，標(biāo)記人組織RNAs與被選的38000人基因片段的矩陣進(jìn)行雜交，比較健康與疾病組織的圖象，用軟件分析點(diǎn)識(shí)別和點(diǎn)定量。使用寡聚核苷酸鑒定新的cDNA克隆，和進(jìn)入表達(dá)載體，使相應(yīng)蛋白能直接表達(dá)，矩陣后可分析蛋白-蛋白和蛋白-DNA的關(guān)系。當(dāng)前第49頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)生物芯片相關(guān)儀器點(diǎn)陣儀：制備芯片。點(diǎn)樣針分為實(shí)心和空心兩種，點(diǎn)樣方式有非接觸噴點(diǎn)和接觸點(diǎn)樣兩種。雜交儀：全自動(dòng)完成調(diào)節(jié)、加探針、漂洗和熱循環(huán)的雜交過程。掃描儀：激光共聚焦或CCD直接成像分析結(jié)果。當(dāng)前第50頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第51頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第52頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第53頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第54頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)QBot超高解析基因篩選暨排列分析儀?；蚓浜Y選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(diǎn)(Gridding)：100000/h基因復(fù)制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復(fù)制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片全自動(dòng)液體分注系統(tǒng)(LiquidHandling):96針，注液量1200l，適合PCR產(chǎn)物。分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)。環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板當(dāng)前第55頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第56頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)QPix半敞開式基因篩選暨排列分析儀(經(jīng)濟(jì)型)基因菌落篩選(ColonyPicking)：3500/h基因排列打點(diǎn)(Gridding)：100000/h基因復(fù)制(Replication)：9696,96384基因重新排列(Re-Arraying)：正確的基因置復(fù)制盤基因微矩陣排列(Micro-Arraying)：20000/片分析軟件：分析、質(zhì)控、上網(wǎng)環(huán)境控制：紫外線照射、空氣濾網(wǎng)、陽極處理鋁板當(dāng)前第57頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)當(dāng)前第58頁\共有76頁\編于星期四\19點(diǎn)QArray第三代半敞開式基因微矩陣排列儀?；蛭⒕仃嚺帕?Micro