10真菌與其他病原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)課件

第十章真菌與其他病原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)1真菌與其他病原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)真菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)梅毒螺旋體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)原蟲的分子生物學(xué)檢驗(yàn)一、真菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)新型隱球菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)真菌fungus廣泛存在于自然界的真核細(xì)胞生物，具細(xì)胞核和細(xì)胞器不含葉綠素和其他光合作用的色素，以寄生和腐生方式獲取營養(yǎng)有性繁殖，無性繁殖全世界有150萬種，絕大多數(shù)對人類無害，少量(約300種)與人類疾病有關(guān)近年感染機(jī)會增加：光譜抗生素、激素、免疫抑制劑、抗癌藥物使用器官移植，導(dǎo)管、插管技術(shù)開展艾滋病患者增多1、白假絲酵母菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)基因組結(jié)構(gòu)特征分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床意義白假絲酵母菌candidaalbican，又稱白色念珠菌；一種條件致病菌廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道、陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病免疫功能低下的人群可引起相關(guān)疾?。浩つw念珠菌病，好發(fā)于皮膚皺褶處粘膜念珠菌病，以鵝口瘡、口角炎、陰道炎最多見內(nèi)臟及中樞神經(jīng)念珠菌病，有肺炎、腸胃炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、腦炎等，偶發(fā)敗血癥傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法：血培養(yǎng)耗時長，陽性率低組織活檢：缺乏典型改變，影響診斷白假絲酵母菌的基因組結(jié)構(gòu)特征二倍體，單倍體基因組長16Mb，8對染色體可產(chǎn)生染色體長度多態(tài)性現(xiàn)象染色體重排、易位、缺失個別染色體三倍體基因組中堿基轉(zhuǎn)換/顛換的頻率高達(dá)1/273，使菌體很好適應(yīng)環(huán)境6419個ORF，其中5918個編碼蛋白質(zhì)功能基因包括：結(jié)構(gòu)基因、形態(tài)相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因、基因信息傳遞基因、致病基因、耐藥基因編碼：黏附素、生物膜、菌絲體的基因分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PCRPCR-斑點(diǎn)雜交DNA指紋技術(shù)：RFLP,RAPD,電泳核型分析，AP-PCR測序芯片臨床意義分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)簡便，快速，靈敏，特異性高利于早期診斷用于菌株分類、分型，耐藥基因檢測2、新型隱球菌的分子生物學(xué)檢驗(yàn)基因組結(jié)構(gòu)特征分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)臨床意義新型隱球菌cryptococcus，環(huán)境腐生菌，廣泛存在于土壤、蔬菜、牛奶、草地、蜂巢、鴿糞中；人、動物主要傳染源呈圓形或卵圓形，外裹由細(xì)胞壁和莢膜組成的被膜多由呼吸道吸入，另有經(jīng)皮膚黏膜、消化道傳染。可產(chǎn)生一種胞外磷脂酶B破壞肺泡中的表面活性物質(zhì)，進(jìn)而改變肺組織的物理特性，使菌體較易在肺內(nèi)形成病灶，數(shù)月內(nèi)經(jīng)血行播散至腦或腦膜，引起炎癥反應(yīng)長期大量應(yīng)用廣譜抗生素、免疫抑制藥、抗癌藥物，接受器官移植術(shù)，白血病AIDS、淋巴肉瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)核病、糖尿病等患者為主要易感人群

隱球菌性腦膜炎、腦膜腦炎

新型隱球菌分為兩種：新生隱球菌：3個變種新生變種，格魯比變種，2者的雜合體格特隱球菌根據(jù)細(xì)胞外莢膜多糖的抗原性差異，分為5種血清型：A、B、C、D、AD傳統(tǒng)檢測方法墨汁染色法真菌培養(yǎng)：“金標(biāo)準(zhǔn)”，陽性率不高血清學(xué)新型隱球菌的基因組結(jié)構(gòu)特征單倍體，基因組約20Mb，14條染色體編碼6574個基因2008年，陳江漢等人用PCR指紋技術(shù)，將129株新型隱球菌分為8個基因型VNI,VNII,---血清型AVNIII---血清型ADVNIV---血清型DVGI,VGII,VGIII---血清型BVGIV---血清型C分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PCR：多擴(kuò)增rDNA復(fù)合體斑點(diǎn)雜交PCR-RFLP：區(qū)分個體，確定個體間的遺傳關(guān)系臨床意義：特異性檢測出新型隱球菌區(qū)別變種，不受治療影響敏感性更高，可用于痰液、支氣管和肺泡灌洗液的檢測二、衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)沙眼衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)肺炎衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)衣原體chlamydia，原核細(xì)胞型微生物，自然界廣泛分布，專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，廣泛寄生于人、哺乳動物、禽類，僅少數(shù)致病能通過0.2μm的濾器，無肽聚糖，對γ-干擾素敏感，基因組小，發(fā)育周期獨(dú)特1、沙眼衣原體chlamydiatrachomatis(CT)人體內(nèi)長期生存并廣泛傳播，不耐熱主要寄生在黏膜細(xì)胞根據(jù)主要外膜蛋白的抗原分為18中血清型常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測分離培養(yǎng)或鏡檢衣原體包涵體，敏感可靠，但易受取材、培養(yǎng)條件、操作者經(jīng)驗(yàn)影響血清學(xué)試驗(yàn)：簡便，快速，但特異性差，易與金葡菌、鏈球菌、淋球菌等發(fā)生交叉反應(yīng)沙眼衣原體的基因組結(jié)構(gòu)特征同時含DNA和RNA具很強(qiáng)的DNA修復(fù)和重組系統(tǒng)，基因組與其他細(xì)菌及宿主細(xì)胞有廣泛的遺傳交換血清型D基因組約1.04Mb894個編碼基因，其中4%編碼基因與其他細(xì)菌有同源序列有1個7493bp隱蔽性質(zhì)粒，與其他生物無同源序列分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)PCR：多擴(kuò)增主要外膜蛋白基因、隱蔽性質(zhì)粒DNA、16SrRNA基因LCR（連接酶鏈反應(yīng)）技術(shù)DNA序列分析基因突變：質(zhì)粒tetM基因(四環(huán)素耐藥)23SrRNA基因(大環(huán)內(nèi)酯類藥物)核糖體蛋白基因L4gyrA基因（氟喹諾酮耐藥）分子生物學(xué)檢驗(yàn)的臨床意義：方法簡便、快速、敏感、特異適用于：無癥狀攜帶者檢測、早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查、基因分析、耐藥檢測2、肺炎衣原體chlamydiapneumoniae(CP)1989年確定，重要的人獸共患病原體人類感染很普遍，血清學(xué)證實(shí)50~90%的成年人CP抗體(+)呼吸道病原體，主要引起人非典型性肺炎，艾滋病、白血病等繼發(fā)感染的重要病原菌之一常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法：病原體分離培養(yǎng)：方法負(fù)責(zé)，耗時，敏感性不高血清學(xué)檢測：具良好的特異性、靈敏度，但機(jī)體產(chǎn)生抗體需幾周時間，不適合早期診斷肺炎衣原體的基因組結(jié)構(gòu)特征肺炎衣原體CWL-029株基因組雙鏈環(huán)狀DNA，1230kb，不含質(zhì)粒，推測有1122個基因，編碼基因1052個，結(jié)構(gòu)RNA基因33個；186個基因在GenBank中未發(fā)現(xiàn)同源基因肺炎衣原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)多用PCR技術(shù)檢測肺炎衣原體，以種特異性抗原MOMP基因?yàn)榘行蛄衅胀≒CRReal-timePCR巢式PCR競爭性PCR臨床意義：早期診斷，流行病學(xué)調(diào)查，耐藥性分析三、支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)肺炎支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)解脲支原體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)支原體mycoplasma，目前所知的能獨(dú)立生活、自行繁殖的最小原核細(xì)胞微生物，不同于細(xì)胞，也不同于病毒種類繁多、分布廣泛、造成危害大，涉及人、動物、植物及昆蟲等，給人類健康和科研工作帶來不利影響0.2~0.3μm大小，沒有細(xì)胞壁，具可塑性、可過濾性、易溶解性；高度多形性基因組小，結(jié)構(gòu)簡單，生物合成、代謝能力有限，可在固體培養(yǎng)基上形成“荷包蛋”樣菌落對人致?。悍窝字гw（肺炎），人型支原體，解脲支原體，生殖器支原體（泌尿生殖道感染）1、肺炎支原體mycoplasmapulmonis(MP)，原發(fā)性非典型性肺炎（肺炎支原體肺炎）的病原體主要經(jīng)飛沫傳染，潛伏期2～3周，發(fā)病率以青少年最高。臨床癥狀較輕，或無癥狀，有個別死亡報道。一年四季均可發(fā)生，秋冬居多。MP的基因組結(jié)構(gòu)特征MP基因組含能量代謝基因，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯必須的基因；維生素、核酸前體、脂肪酸合成的基因較少合成細(xì)胞壁、氨基酸的基因缺失肺炎支原體M129株單一環(huán)狀dsDNA，816394bp677個ORF，39個RNA編碼基因；75.9%ORF與其他生物有相似性肺炎支原體肺炎臨床表現(xiàn)：影像學(xué)檢查：胸片陰影顯著，病變可很輕微，也可很廣泛臨床表現(xiàn)和胸部X線檢查并不具特征性，要明確診斷，需要進(jìn)行病原體的檢測肺炎支原體病原學(xué)診斷支原體培養(yǎng)：標(biāo)本：可為鼻咽拭子或吸液、痰、胸膜積液、支氣管肺泡灌洗物、氣管吸液和肺組織等培養(yǎng)：SP-4和改良的Hayflick肉湯和瓊脂平板。一般在接種過后4~20天出現(xiàn)菌落缺點(diǎn)：肺炎支原體培養(yǎng)較為困難，需要特殊營養(yǎng)培養(yǎng)基，且生長速度較一般細(xì)菌慢許多，臨床標(biāo)本含量低，易污染，陽性率很低肺炎支原體病原學(xué)診斷免疫學(xué)檢測：直接免疫熒光、免疫印跡、雙單抗夾心酶免疫抗原捕獲法MP與其他支原體有共同抗原，免疫學(xué)檢測假陽性率高血清學(xué)檢測：目前仍為國際上通用的診斷標(biāo)準(zhǔn)，急性感染血清學(xué)診斷應(yīng)包括IgG和IgM抗體。在成人患者，IgM抗體陽性是急性感染的指標(biāo)，但陰性不能排除支原體感染，此時IgM抗體可能缺失IgG抗體可用于回顧性診斷，對于肺炎支原體肺炎的早期診斷價值不大肺炎支原體分子生物學(xué)檢測方法PCR,qPCR：幾乎能檢測所有已知的人類致病支原體，靶序列：16SrRNA基因可變區(qū)、保守區(qū)，P1蛋白基因區(qū)具有很高的敏感性和特異性，且檢測方法快速、便捷但感染后肺炎支原體的持續(xù)存在、無癥狀的支原體攜帶都可能造成假陽性，其臨床價值尚未完全確立其它：核酸雜交，PCR-RFLP，等臨床意義：早期診斷，流行病學(xué)調(diào)查，耐藥基因分析2、解脲支原體ureaplasmaurealyticum(UU)，脲原體屬中唯一的1個種，因生長需要尿素而得名一類原核細(xì)胞微生物，體積介于細(xì)菌與病毒之間，是人類泌尿生殖道的常見病原體，與許多泌尿生殖道感染癥、圍產(chǎn)期感染和不育癥等都有關(guān)系，性傳播疾病的病原體之一。UU后，患者大多無明顯癥狀，很難被患者覺察，也易造成漏診菌落微小，直徑僅15～25μm，須在低倍顯微鏡下觀察，故舊稱T株(tinystrain)。菌落表面有粗糙顆粒，在合適條件下可轉(zhuǎn)成典型的荷包蛋樣菌落生長需要膽固醇和尿素，分解尿素為其代謝特征，產(chǎn)生氨氮，使培養(yǎng)基pH上升，患者小便往往帶有臊腥味解脲支原體基因組環(huán)狀dsDNA,751719bp，GC含量低613個編碼蛋白質(zhì)的基因，39個編碼RNA的基因；53%蛋白編碼基因具生物學(xué)共，28%為假基因編碼UU抗原的基因長約1200bp，N端1/3為保守區(qū)，包含群特異的抗原決定簇，C端2/3是由重復(fù)序列組成的可變區(qū)，包含型特異的抗原決定簇解脲支原體實(shí)驗(yàn)室檢測形態(tài)學(xué)檢查：Giemsa染色法將其染成淡紫色

支原體培養(yǎng)：“金標(biāo)準(zhǔn)”，但UU培養(yǎng)較難，用時長、操作復(fù)雜、敏感性低、特異性不高抗原檢測：UU抗原是解脲支原體感染時被識別的主要外膜抗原，具有種特異性。報道方法有：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光標(biāo)記抗體、肺炎支原體膜蛋白單克隆抗體、反向間接血凝法，直接檢測分泌物和體液中支原體抗原，具有很高的特異度和靈敏度血清學(xué)方法：有支原體特異性血清學(xué)檢測、支原體的非特異血清學(xué)方法，對支原體肺炎能起輔助診斷的作用，但檢測特異性抗體的方法尚不能達(dá)到早期快速診斷的目的解脲衣原體Giemsa染色解脲支原體分子生物學(xué)檢測方法PCR：簡單、快速、特異、準(zhǔn)確早期診斷鑒別診斷多種病原體的混合感染分型，耐藥基因檢測，流行病學(xué)研究核酸雜交，測序四、梅毒螺旋體分子生物學(xué)檢驗(yàn)梅毒螺旋體的基因組結(jié)構(gòu)特征梅毒螺旋體的分子生物學(xué)檢驗(yàn)臨床意義梅毒螺旋體是梅毒的病原體，因其透明，不易著色，故又稱蒼白螺旋體梅毒是一種廣泛流行的性病。梅毒螺旋體只感染人類，通過性接觸傳染，或由胎盤傳給胎兒，在胎兒內(nèi)臟及組織中大量繁殖，可引起胎兒死亡或流產(chǎn)。單細(xì)胞原核生物，形態(tài)細(xì)長，5-15×0.1-0.2μm，彎曲成螺旋狀電鏡下顯示其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，從外向內(nèi)分為：外膜（主要由蛋白質(zhì)、糖及類脂組成）、軸絲（主要由蛋白質(zhì)組成）、圓柱形菌體（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及胞漿內(nèi)容物）實(shí)驗(yàn)檢查形態(tài)學(xué)：暗視野或墨汁顯影，見運(yùn)動活潑的密螺旋體即可診斷。方法簡便，但重復(fù)性差。血清學(xué)檢查非螺旋體抗原試驗(yàn)：用正常牛心肌的心類脂為抗原，檢測病人血清中的反應(yīng)素。反應(yīng)素在第一期梅毒病變出現(xiàn)后1-2周就可測出，第二期陽性率幾乎達(dá)100%，第三期陽性率較低。本試驗(yàn)所用抗原是非特異的，檢測的抗體時應(yīng)排除假陽性反應(yīng)，結(jié)合病史，臨床表現(xiàn)及多次的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。螺旋體抗原試驗(yàn)：抗原為梅毒旋體，以檢測血清中的特異性抗體，該試驗(yàn)特異性高。分子生物學(xué)檢驗(yàn)：特異，敏感五、原蟲的分子生物學(xué)檢驗(yàn)弓形蟲的分子生物學(xué)檢驗(yàn)瘧原蟲的分子生物學(xué)檢驗(yàn)溶組織內(nèi)阿米巴的分子生物學(xué)檢驗(yàn)原蟲單細(xì)胞真核生物，整個蟲體由一個細(xì)胞構(gòu)成，具有生命活動的全部功能。體積微小，基本結(jié)構(gòu)包括：胞膜、胞質(zhì)及胞核。胞核內(nèi)有染色質(zhì)、核仁，富含DNA和RNA自然界分別廣泛，醫(yī)學(xué)原蟲包括寄生在人體的腔道、體液、組織或細(xì)胞內(nèi)的致病及非致病性原蟲，約有40余種。有些原蟲，如弓形蟲、瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、溶組織內(nèi)阿米巴，可對人體可造成嚴(yán)重危害。瘧原蟲瘧原蟲：人瘧疾的病原體瘧疾是一種嚴(yán)重危害人體健康的寄生蟲病，全世界約1/2人口受威脅。瘧原蟲寄生于人及多種哺乳動物，少數(shù)寄生于鳥類和爬行類動物，已知有130余種；有嚴(yán)格的宿主選擇性。瘧原蟲的基本結(jié)構(gòu)：包括核、胞質(zhì)和胞膜，環(huán)狀體以后各期尚有消化分解血紅蛋白后的最終產(chǎn)物—瘧色素。血片經(jīng)姬氏或瑞氏染液染色后，核呈紫紅色，胞質(zhì)為天藍(lán)至深藍(lán)色，瘧色素呈棕黃色、棕褐色或黑褐色。除了瘧原蟲本身的形態(tài)特征不同之外，被寄生的紅細(xì)胞在形態(tài)上也可發(fā)生變化。被寄生紅細(xì)胞的形態(tài)有無變化以及變化的特點(diǎn)，對鑒別瘧原蟲種類很有幫助。

瘧原蟲的實(shí)驗(yàn)診斷1．病原學(xué)診斷厚、薄血膜染色鏡檢是目前最常用的方法。從外周血液中檢出瘧原蟲是確診的最可靠依據(jù)（經(jīng)姬氏或瑞氏染液染色）2．免疫學(xué)診斷循環(huán)抗體檢測：常用間接熒光抗體試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等?？贵w在患者治愈后仍能持續(xù)一段時間，且廣泛存在個體差異，檢測抗體主要用于流行病學(xué)調(diào)查、防治效果評估及輸血對象的篩選，在臨床上僅作輔助診斷用。循環(huán)抗原檢測：用血清學(xué)方法檢測瘧原蟲的循環(huán)抗原能更好地說明受檢對象是否有活動感染。常用放射免疫試驗(yàn)、抑制法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和快速免疫色譜測試卡等。瘧原蟲的實(shí)驗(yàn)診斷3．分子生物學(xué)技術(shù)PCR和核酸探針已用于瘧疾的診斷，分子生物學(xué)檢測技術(shù)的最突出的優(yōu)點(diǎn)是對低原蟲血癥檢出率較高。用核酸探針檢測惡性瘧原