蛋白樣品制備

雙向電泳之樣品的制備2008-04-0221:58:37|分類：默認(rèn)分類|舉報(bào)|字號訂閱一般性原則：樣品制備是雙向電泳中最為關(guān)鍵的一步，這一步處理的好壞將直接影響2-DE結(jié)果。目前并沒有一個(gè)通用的制備方法，盡管處理方法是多種多樣，但都遵循幾個(gè)基本的原則：1） 盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2） 減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；3） 破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于完全變性狀態(tài)。根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑（chaotropes）,主要包括尿素（Urea）和硫月尿（thiourea）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，早期常使用NP-40、TritonX-100等非離子去垢劑，近幾年較多的改用如CHAPS與Zwittergent系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducingagents），最常用的是二硫蘇糖醇（DTT），也有用二硫赤薛糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP）等。當(dāng)然，也可以選擇性的加入Tris-base，蛋白酶抑制劑（如EDTA、PMSForProteaseinhibitorc°Cktails）以及核酸酶。樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合，以達(dá)到對樣品蛋白的最大抽提。在對樣品蛋白質(zhì)提取的過程中，必須考慮到去除影響蛋白質(zhì)可溶性和2DE重復(fù)性的物質(zhì)，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會(huì)阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會(huì)降低等電聚焦的電壓，甚至?xí)p壞IPG膠條；這樣都會(huì)造成2-DE的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續(xù)工作的完善或改進(jìn)獲得補(bǔ)償。核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，并防止產(chǎn)生泡沫；而加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在最終的2D膠上。脂類和多糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時(shí)間太長；也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。因此，處理方法必須根據(jù)不同的樣品、所處的狀態(tài)以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵髞磉M(jìn)行選擇。1.培養(yǎng)細(xì)胞(culturecell)樣品處理方法：培養(yǎng)動(dòng)物組織細(xì)胞由于沒有細(xì)胞壁，因此可以將細(xì)胞收集下來，直接加入裂解緩沖液(Lysisbuffer)抽提總蛋白。裂解緩沖液有多種配方，本實(shí)驗(yàn)室主要采用如下成份：7MUrea,2MThiourea,4%(w/v)CHAPS,40mMTris-Base,40mMDTT,2%PharmalytepH3-10.其他常用的裂解緩沖液如下：9.5Murea,2%(w/v)CHAPS,0.8%(w/v)PhamarlytepH3-10,1%(w/v)DTTand5mMPefabl°Cproteinaseinhibitor;加入0.3-1%SDS在95C煮樣品5mins，冷卻后加入至少5倍體積的以)或(B)裂解液?？偟鞍壮樘岢绦颍号囵B(yǎng)細(xì)胞的收集；用磷酸緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次(室溫，1000g，各2min)；將細(xì)胞分裝到1.5mlEppendof管中，吸干殘留的PBS；加入裂解緩沖液(1.5x106個(gè)細(xì)胞大約加入100口L裂解液)，在室溫振蕩1h，使其充分溶解；4C，40,000g，離心1h；吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分裝至Eppendof管里保存在-78C備用。組織樣品處理方法：對大多數(shù)從動(dòng)物或植物組織里提取總蛋白質(zhì)而言，同樣沒有一種通用的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出一種對植物樹葉總蛋白的方法。三氯醋酸一丙酮沉淀法(TCA/acetoneprecipitation)提取植物樹葉總蛋白程序：在液氮中研碎葉片；懸浮于含10%三氯醋酸(TCA)和0.07%B-巰基乙醇(可用DTT替代)的丙酮溶液在一20C的冰浴；讓蛋白質(zhì)沉淀過夜然后離心(4C，40,000g,1h)，棄上清；重懸沉淀浮于含0.07%。-巰基乙醇的冰預(yù)冷丙酮溶液里；離心(4C，40,000g,1h)后真空干燥沉淀；用(A)或(B)裂解液溶解沉淀，離心(4C，40,000g,1h)。(7)Brandford法定量蛋白，然后分裝至Eppendof管里保存在-78°C備用。超速離心法：取材；用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g樣品加入0.5ml裂解液，使用組織勻漿器勻漿30s；組織懸液15C,10000xg離心10min；上清液4C,150000xg超速離心45min；小心避開上層漂浮的脂質(zhì)層，吸取離心上清6C40,000g再次離心50min；取離心上清。Bradford法定量，分裝后置75C保存。文獻(xiàn)報(bào)道較多的裂解液配方LysisbufferA(9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)FinalconcentrationAmountUrea(FW60.06,Sigma,>99.5%)9M10.8gCHAPS(FW614.89,Sigma,>98%)4%(w/v)0.8gUltrapureHOto20mlpreparefreshorstoreinaliquotsat-20CAcocktailofproteaseinhibitorsDTT(FW154.25,Promega)1%13PL/200PLLysisbuffer(15.5Xstock),-20CLysisbufferB(7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)

LysisbufferC40mMTris-base(pH9.5)inultrapureH2OLysisbufferD(8Murea,4%CHAPS,40mMTris(base),40ml)FinalconcentrationAmountUrea(FW60.06)8M9.6gCHAPS4%(w/v)0.8gTrisbase(FW121.1)UltrapureHO2to20mlpreparefreshorstoreinaliquotsat-20°CAcocktailofproteaseinhibitorsDTT(FW154.25,Promega)1%13四L/200此Lysisbuffer(15.5Xstock),-20CLysisbufferE(5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)Finalconc.AmountUrea5M3.0gThiourea(FW76.12)2M1.52gSB3-10(FW307.5)2%0.2gCHAPS2%0.2gUltrapureHO2to10mlAcocktailofproteaseinhibitors1%13此/200此LysisbufferDTT(FW154.25,Promega)(15.5Xstock),-20°CLysisbufferF100口LSDSsamplesolution(1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol注：CA、蛋白酶抑制劑混合物和DTT在臨用前加入。廣譜蛋白酶抑制劑混合物(如加tris可不用此混合物)成分終濃度蛋白酶抑制劑混合物PMSF35Mg/mlor1mMEDTA0.3mg/ml(1mM)抑肽素0.7Mg/ml亮肽素0.5Mg/ml其中C-F是分步法提取的4種裂解液配方,C適于提取水溶性蛋白，D是經(jīng)典配方，E適于提取膜蛋白配方，F(xiàn)適于提取難溶的沉淀蛋白。閱讀(326)|評論(0)蛋白質(zhì)組研究第一步：雙向電泳蛋白樣品制備［選購寶典］【字體：大中小】時(shí)間：2006年02月13日來源：生物通摘要：在直擊蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)全過程一文中就提到過，目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要是兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)工作流程基于凝膠的工作流程(Gel-basedworkflow)和基于液相色譜的工作流程(LC-basedworkflow)。其中對于前者而言，雙向電泳技術(shù)是核心，而這核心中的核心就是電泳的第一步：蛋白樣品制備。這是因?yàn)椴幌耠p向電泳的其它過程有儀器，有大致相似的操作程序，蛋白樣品由于其結(jié)構(gòu)特性各異，又必須使其完全溶解和盡可能少的化學(xué)修飾，所以不可能有一個(gè)通用的技術(shù)，只能通過大量的實(shí)驗(yàn)來積累經(jīng)驗(yàn)。正如開篇所引用的兩句話中包含的深意：在研究蛋白的過程中，既需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)募夹g(shù)流程，規(guī)范的操作手段來確保蛋白研究的完整性，也需要將其看成是獨(dú)特而奇妙的個(gè)體，結(jié)合以往經(jīng)驗(yàn)但又不拘泥于經(jīng)驗(yàn)，才能真正揭開她神秘的面紗。為什么要進(jìn)行樣品制備“為什么要進(jìn)行樣品制備？電泳的目的不就是分離嗎？”剛接觸雙向電泳的小菜鳥有可能就會(huì)這么問。這個(gè)問題很好回答，這是由于目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)（spot），而樣品中的蛋白種類可達(dá)到10萬種以上，因此樣品的制備是必須的。另外比如像對臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)研究目的，由于臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一，如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類細(xì)胞，而這類細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。所以常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細(xì)胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較，而蛋白質(zhì)組研究的通常是單一的細(xì)胞類型，因此需要進(jìn)行有效的樣品制備。但是為什么要進(jìn)行不同步驟的樣品制備呢？這不僅僅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法來配合，而且在制備樣品的時(shí)候，首先需要明確的是什么是實(shí)驗(yàn)的最終目的：是分離盡可能多的蛋白還是分離樣品中某些感興趣的蛋白，這些直接決定了你的制備方法，也決定了實(shí)驗(yàn)的成功與否。由于想要分離的蛋白必須是完全溶解的，溶解的效果取決于裂解、破碎、沉淀、溶解的過程以及去污劑的選擇和各種溶液的組成，因此如果是只對樣品中的一部分蛋白感興趣，可采取預(yù)分離的方法，如欲分析的蛋白來自細(xì)胞器（細(xì)胞核、線粒體和原生質(zhì)膜），則應(yīng)先采取超速離心或其他方法將細(xì)胞器分離出來再溶解蛋白；如果是希望分離出盡可能多的蛋白，比如進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，則可以將細(xì)胞或組織中的蛋白分成幾部分，分級制備。樣品制備的原則應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。以上這五項(xiàng)原則是根據(jù)北大人類疾病研究中心講座內(nèi)容改編而來，基本上可以說是囊括了樣品制備過程中的抽象注意事項(xiàng)，之后還會(huì)提到具體的注意事項(xiàng)。樣品制備流程蛋白樣品制備過程簡而言之就是三步：破碎、沉淀蛋白和去除雜質(zhì)。雖然說出來不過寥寥的十個(gè)字，但是這幾個(gè)過程經(jīng)過這么多年，還沒有那位研究人員可以說自己已經(jīng)完全掌握，面對任何蛋白制備手到擒來。破碎一一最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解原則樣品制備的第一步當(dāng)然是細(xì)胞或者其它樣品的破碎，這一步看似簡單，但是操作中一旦方法不當(dāng)，就有可能會(huì)丟失樣品中的蛋白和導(dǎo)致蛋白被修飾。要想毫發(fā)無損的通過這一關(guān)，首先就要分析樣品的來源，是易碎的細(xì)胞還是堅(jiān)硬的組織？是植物細(xì)胞還是真菌？要做到有的放矢，才能事半功倍。破碎的方法有許多種，包括循環(huán)凍融法、滲透法、去污劑法、酶裂解法、超聲波法、高壓法、液氮研磨法、機(jī)械勻漿法和玻璃珠破碎法等（可以歸納為機(jī)械法、化學(xué)法和物理法），這些方法有不同的應(yīng)用范圍，但基本的原則都是要以最小的限度減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解，這也就是在樣品制備破碎這一步的關(guān)鍵所在。就這些方法具體而言，選擇的時(shí)候如果是較易破碎的細(xì)胞組織，就可以采用滲透法，這種方法十分溫和，適用于血細(xì)胞和組織培養(yǎng)細(xì)胞。而對于細(xì)菌細(xì)胞，則可以采用凍融法，利用液氮一次或者多次反復(fù)凍融來裂解細(xì)胞。去污劑法適用于組織培養(yǎng)細(xì)胞，將樣品懸浮于含有去污劑的裂解液中，可以溶解細(xì)胞膜釋放內(nèi)含物，如果裂解液中含有SDS，為了不干擾等電聚焦，可以將裂解的樣品用含有過量的非離子或者兩性離子去污劑的溶液稀釋，或用丙酮沉淀法去除SDS。另外酶裂解法適用于植物組織、細(xì)菌和真菌細(xì)胞。除了這幾種較溫和的方法，一些較劇烈的方法也有自己的適用范圍，如超聲波法適用于細(xì)胞懸浮液，高壓法常用于有細(xì)胞壁的微生物，研磨法適用于微生物和組織，而機(jī)械勻漿法是機(jī)體軟組織破碎最常用的方法之一，玻璃珠破碎法則用于細(xì)胞懸浮液和微生物的破碎。為了確保在這些方法過程中減少熱量的產(chǎn)生，可以在低溫（冰浴或者液氮）下操作，并且由于在破碎過程中會(huì)產(chǎn)生蛋白酶，使蛋白水解，因此也要注意在含有蛋白酶抑制劑的裂解液中進(jìn)行。

沉淀蛋白一一可溶性是關(guān)鍵一般而言，在破碎樣品獲得蛋白之后常常需要通過蛋白沉淀去除干擾物質(zhì)和濃縮樣品，在這個(gè)步驟中重點(diǎn)是要獲得可以重新溶解的蛋白，因此對所研究的具體蛋白的特性需要有詳細(xì)的掌握，這也是體現(xiàn)研究人員工作能力的“checkpoints”。常見的蛋白沉淀方法有以下幾種:沉淀方法原理方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)硫酸銨沉淀法高鹽濃度的緩沖液促進(jìn)蛋白聚合沉淀在蛋白終濃度大于1mg/mL并含有EDTA的緩沖液（＞50mmol/L）將硫酸銨加至飽和，攪拌10-30分鐘，離心分離預(yù)分離不能得到全部蛋白，并且殘留的硫酸銨和核酸會(huì)影響等電聚焦三氯醋酸（TCA）沉淀法在蛋白溶液中加入TCA，使其終濃度為10%-20%，冰浴30分鐘。被沉淀的蛋白難再溶解，并且長時(shí)間將樣品置于這種低pH溶液中會(huì)引起蛋白降解和修飾丙酮沉淀法在蛋白溶液中加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，20r沉淀2小時(shí)，離心收集蛋白。TCA-丙酮沉淀法用含20mmol/LDTT或0.07%。-巰基乙醇的10%TCA溶液20r沉淀45分鐘以上，離心收集，再用20mmol/LDTT0.07%）-巰基乙醇清洗，空氣（冷凍）干燥。雙向電泳常用方法醋酸銨沉淀法用醋酸銨的甲醇溶液沉淀，再用酚抽提，0.1mol/L甲醇清洗，再用丙酮清洗。適用含有大量步驟繁瑣去除雜質(zhì)一一關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾在樣品中常常會(huì)含有像核酸、多糖、去污劑和代謝物等非蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需要去除，否則會(huì)影響雙向電泳的結(jié)果，這個(gè)過程有時(shí)會(huì)造成蛋白的丟失以及蛋白的化學(xué)修飾和解聚，特別是后者會(huì)導(dǎo)致雙向電泳圖譜中蛋白點(diǎn)的增多（由于電荷的改變），所以操作中要多加注意。核酸的清除0對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會(huì)出現(xiàn)假象遷移和條紋。0解決的方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)（SCA）同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。多糖的清除0對電泳的影響：帶負(fù)電的多糖會(huì)與蛋白形成復(fù)合物，導(dǎo)致拖尾和影響聚焦。0解決的方法：利用超離心和高pH，高離子強(qiáng)度，和TCA等沉淀法。去污劑的清除0對電泳的影響：SDS能與蛋白形成帶負(fù)電的復(fù)合物，對等電聚焦影響大，需要清除。0解決的方法：用含載體兩性電解質(zhì)或兩性離子去污劑（CHAPS、TritonX-100或NP-40）的溶脹液稀釋，或者丙酮沉淀法。鹽離子和外源帶電小分子的清除0對電泳的影響：樣品中的鹽會(huì)增加凝膠條的電導(dǎo)，使其無法達(dá)到設(shè)置的電要，從而影響蛋白質(zhì)聚焦，帶電小分子會(huì)引起水的流動(dòng)，使膠條的一端腫脹而另一端變干，導(dǎo)致兩端的酸、堿性蛋白無法聚焦，造成拖尾或丟失。0解決的方法：常用透析去除鹽成分，TCA-丙酮沉淀法可以清除小分子。樣品制備注意事項(xiàng)1.蛋白質(zhì)水解當(dāng)細(xì)胞破碎的時(shí)候，蛋白水解酶就會(huì)被釋放出來或被激活，使雙向電泳結(jié)果復(fù)雜化，影響最終結(jié)果分析。為了避免這些情況的出現(xiàn)，建議在樣品制備時(shí)盡可能在低溫下進(jìn)行。此外，許多蛋白酶在PH9以上就失活了，因此Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質(zhì)往往能抑制蛋白水解。但是有些蛋白酶在上述條件下仍然保持著活性，此時(shí)應(yīng)當(dāng)使用蛋白酶抑制劑。每一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此建議復(fù)合使用蛋白酶抑制劑，如廣譜蛋白酶抑制劑“雞尾酒”，見下表(來自《蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)》)。蛋白酶抑制劑有效抑制的酶PMSF(Pheylmethylsulfonylfluoride)是很常見的抑制劑，使用濃度為1mmol/L不可逆抑制絲氨酸水解酶和一些半胱氨酸水解酶。AEBSF絲氨酸抑制劑，使用濃度為4mmol/LAEBSF的抑制活性與PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低EDTA，EGTA，使用濃度為1mmol/L通過鰲合蛋白酶維持活性所必需的金屬離子來抑制金屬蛋白酶。多肽蛋白酶抑制劑，使用濃度為2-20ug/ml亮肽素(Leupeptin)能抑制多種絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素(pepstatin)抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶(aprotinin)能抑制許多絲氨酸蛋白酶；苯丁抑制劑(bestatin)能抑制氨基酸多肽酶TLCk，TPCK，使用濃度為0.1-0.5mmol/L不可逆的抑制絲氨酸和半胱氨酸的蛋白酶卞脒(Benzamidine)使用濃度為抑制絲氨酸蛋白酶1-3mmol/L2.特殊樣品的制備低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離。現(xiàn)常用預(yù)分級+窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離