第十一章高效液相色譜法

11.1高效液相色譜法定義及特點(diǎn)11.2高效液相色譜與氣相色譜的區(qū)別11.3高效液相色譜分類(lèi)及分離原理11.4高效液相色譜主要組成部件11.5高效液相色譜在環(huán)境應(yīng)用11.6高效液相色譜分析方法的建立11.7高效液相色譜保養(yǎng)與維護(hù)11.8高效液相色譜定性與定量分析1當(dāng)前第1頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)11.1高效液相色譜法定義：液相色譜法是指以流動(dòng)相為液體的色譜技術(shù)。采用顆粒十分細(xì)的高效固定相，并采用高壓泵輸送流動(dòng)相，全部工作通過(guò)儀器來(lái)完成，這種新的色譜法叫高效液相色譜法。2當(dāng)前第2頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)高壓：液相色譜法以液體為流動(dòng)相，液體流經(jīng)色譜柱時(shí)，

受到的阻力較大，為了能使其迅速通過(guò)色譜柱，須

對(duì)載液施加高壓，150-350*105Pa

；高速：采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快。只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需數(shù)小時(shí)；高效：柱填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻，傳質(zhì)阻力小，因而柱效高，數(shù)分鐘完成數(shù)百物質(zhì)的分離；高靈敏度：紫外檢測(cè)器最小檢測(cè)量10-9g，熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。應(yīng)用范圍廣：約80%的有機(jī)物，特別是高沸點(diǎn)、大分子和熱穩(wěn)定性差的有機(jī)化合物；高效液相色譜特點(diǎn)3當(dāng)前第3頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

相同：兼具分離和分析功能，

均可以在線(xiàn)檢測(cè)11.2高效液相色譜與氣相色譜比較分析對(duì)象流動(dòng)相柱分離操作條件主要差別：4當(dāng)前第4頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)HPLC與GC異同點(diǎn)氣相色譜高效液相色譜分析對(duì)象：只限于分析氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物，只能分析20%的化合物流動(dòng)相：采用的有限幾種惰性氣體，只有運(yùn)載作用，對(duì)組分作用??；無(wú)毒，易于處理；操作條件：加溫操作，進(jìn)樣口必須高溫。分析對(duì)象：可以分析

高沸點(diǎn)高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這種物質(zhì)占有機(jī)物的80%；流動(dòng)相：采用流動(dòng)相為液體，除了運(yùn)載作用，還與組分作用，因此，它對(duì)分離貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離；流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高；

操作條件：室溫、高壓。當(dāng)前第5頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)按固定相分類(lèi)按分離機(jī)理分類(lèi)液液色譜法LLC液固色譜法LSC分配色譜法吸附色譜法離子交換色譜法分子排阻色譜法化學(xué)鍵合色譜法親合色譜法膠束色譜法HPLC11.3HPLC的分類(lèi)與基本原理

高效液相色譜法的分類(lèi)6當(dāng)前第6頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

一、液液分配色譜法（LLC）二、液固吸附色譜法（LSC）三、化學(xué)鍵合相色譜法（CBC）四、離子對(duì)色譜法五、離子色譜法7當(dāng)前第7頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

一、液液分配色譜法基本概念：色譜分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)不同而分離的色譜法（LLC），稱(chēng)為液-液分配色譜。特點(diǎn)：流動(dòng)相和固定相為載體+固定液；流動(dòng)相和固定相應(yīng)互不相容，兩者之間有一明顯的分界面。當(dāng)前第8頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)分離機(jī)制：

由于樣品組分溶入固定相(s)與流動(dòng)相（L）達(dá)到“平衡”分配系數(shù)K的差別而分離。分配達(dá)平衡時(shí)，服從分配系數(shù)公示K=Cs/CL組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度差別越大（K越大），分離效果越好9當(dāng)前第9頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)正相液液色譜法（NLLC）：固定液極性>流動(dòng)相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱，適于分離極性組分。反相液液色譜法（RLLC）：固定液極性<流動(dòng)相極性極性的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分。

液液分配色譜分類(lèi)10當(dāng)前第10頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對(duì)非極性流動(dòng)相

正已烷、環(huán)已烷

3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強(qiáng)化合物.

酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡(jiǎn)稱(chēng)ODS）、C82.極性流動(dòng)相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個(gè)HPLC應(yīng)用的80%左右5.組分流出順序

極性大先洗出

液液分配色譜分類(lèi)11當(dāng)前第11頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)液固吸附色譜法流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑

二、液固吸附色譜12當(dāng)前第12頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)吸附脫附再吸附再脫附

…分離過(guò)程是一個(gè)吸附－脫附的平衡過(guò)程。液固吸附色譜分離機(jī)理：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異作用機(jī)制：溶質(zhì)分子（X）和溶劑分子（S）對(duì)吸附劑表面的競(jìng)爭(zhēng)吸附，對(duì)吸附劑表面的活性中心發(fā)生吸附競(jìng)爭(zhēng)。組分分子對(duì)活性中心的競(jìng)爭(zhēng)能力的大小決定了它們保留值的大小。被活性中心吸附越強(qiáng)的組分分子越不容易被流動(dòng)相洗脫，k值就大；反之k值就小。組分之間的k值相差越大，分離越容易。

用下式表示：

Xm+nSaXm+nSa13當(dāng)前第13頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

三、化學(xué)鍵合相色譜法（CBC）基本概念：借助于化學(xué)反應(yīng)的方法將有機(jī)分子以共價(jià)鍵連接在色譜單體（硅膠表面硅膠醇）上而獲得的固定相稱(chēng)為化學(xué)固定相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱(chēng)為化學(xué)鍵合相色譜法。特點(diǎn)：化學(xué)鍵合色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法；

液液色譜發(fā)展而來(lái)；14當(dāng)前第14頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

化學(xué)鍵合色譜分類(lèi)15當(dāng)前第15頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

化學(xué)鍵合色譜分離機(jī)制反相鍵合色譜法：分離機(jī)理較復(fù)雜，目前比較合理解釋非極性鍵合相色譜保留特征的理論是疏溶劑作用理論和雙保留機(jī)制。正相鍵合色譜法：正相鍵合色譜的保留機(jī)制既有吸附的因素也有分配的因素。16當(dāng)前第16頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)正反相色譜中極性和保留時(shí)間的關(guān)系17當(dāng)前第17頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

定義：在流動(dòng)相中加入與被測(cè)定離子相反電荷的離子對(duì)試劑，使之行成中性的離子對(duì)化合物，以分離離子型化合物或可離子化的化合物的方法。分類(lèi)：正相離子對(duì)色譜法（NPIC）和反相離子對(duì)色譜法（RPIC）正相離子對(duì)色譜法（NPIC）很少使用，故只討論反相離子對(duì)色譜法。

四、離子對(duì)色譜法18當(dāng)前第18頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

離子對(duì)色譜機(jī)理19當(dāng)前第19頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

離子對(duì)色譜機(jī)理20當(dāng)前第20頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)固定相：非極性鍵合相（C8和C18）流動(dòng)相：甲醇（乙腈）-水+離子對(duì)試劑

離子對(duì)色譜固定相和流動(dòng)相21當(dāng)前第21頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

五、離子交換色譜法基本概念：是基于離子交換樹(shù)脂可解離的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換。根據(jù)這些離子對(duì)交換劑具有不同的親和力而將它們分離的色譜分析法。分離機(jī)制：組分在固定相發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)，組分與離子交換劑之間親和力不同而被分離；22當(dāng)前第22頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)固定相：陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)酸性和弱酸性陰離子交換樹(shù)脂：強(qiáng)堿性和弱堿性23當(dāng)前第23頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)流動(dòng)相：應(yīng)用：24當(dāng)前第24頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)離子交換色譜法油田水質(zhì)中的陰離子分析固定相：薄殼型陰離子交換樹(shù)脂(3×250mm)流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1

Na2CO3

六、離子色譜法詳見(jiàn)十二章25當(dāng)前第25頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)HPLC的儀器組成色譜泵自動(dòng)進(jìn)樣器色譜柱及柱溫箱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)流動(dòng)相11.5高效液相色譜的流程及主要部件26當(dāng)前第26頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)HPLC儀器結(jié)構(gòu)圖注射器進(jìn)樣器高壓泵混合室溶劑預(yù)柱接頭色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)系統(tǒng)27當(dāng)前第27頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)一、主要部件高壓輸液泵進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)記錄和處理系統(tǒng)此外，根據(jù)需要配置流動(dòng)相在線(xiàn)脫氣裝置、梯度淋洗裝置、自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、柱后反應(yīng)系統(tǒng)等28當(dāng)前第28頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)液相色譜的基本流程圖流動(dòng)相

泵色譜柱檢測(cè)器AEGBCDF進(jìn)樣閥

泵輸液分離檢測(cè)記錄進(jìn)樣29當(dāng)前第29頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

1．高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀的是核心部件。

(a)功能:驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相和樣品通過(guò)色譜分離柱和檢測(cè)系統(tǒng)

(b)特性：應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕。

(c)分類(lèi):常用的輸液泵分為恒流泵（常用）和恒壓泵兩種。30當(dāng)前第30頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.梯度淋洗裝置

梯度淋洗裝置：在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類(lèi)和比例即不斷改變其極性（兩個(gè)泵）

梯度洗脫的實(shí)質(zhì)：是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的濃度配比，來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分的K值，使所有譜帶都以最佳平均K值通過(guò)色譜柱。

梯度洗脫與程序升溫：在梯度洗脫中溶質(zhì)K值的變化是通過(guò)溶劑的極性、pH值和離子強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)的，用于分離組分性質(zhì)差別較大的復(fù)雜樣品；而程序升溫是借改變溫度來(lái)影響溶質(zhì)的K值，用于分離寬沸程的混合樣品。31當(dāng)前第31頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

分類(lèi)：根據(jù)溶劑混合時(shí)所受的壓力分為兩種類(lèi)型低壓梯度（外梯度）高壓梯度（內(nèi)梯度）

梯度洗脫的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于泵系統(tǒng)32當(dāng)前第32頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)外梯度:

不同極性的溶劑在常壓下按一定的比例混合，利用1臺(tái)高壓輸液泵至入色譜柱。

常壓下先混合后進(jìn)泵，故稱(chēng)為外梯度（低壓梯度）內(nèi)梯度:2臺(tái)高壓泵,每臺(tái)泵輸送一種溶劑，配比由設(shè)定的程序控制。多種溶劑混合前分別由泵增壓入梯度混合室，混合后進(jìn)入柱系統(tǒng)。33當(dāng)前第33頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)34當(dāng)前第34頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)手動(dòng)進(jìn)樣3．進(jìn)樣系統(tǒng)

35當(dāng)前第35頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣自動(dòng)進(jìn)樣的樣品量可連續(xù)調(diào)節(jié)，進(jìn)樣重復(fù)性高，適合做大量樣品分析。36當(dāng)前第36頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)4.分離系統(tǒng)——色譜柱

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。功能：分離樣品中的各個(gè)物質(zhì)一般用直型柱柱長(zhǎng)為10～100cm，

分析型柱內(nèi)徑2～5mm，制備型內(nèi)徑較大為6～10mm柱效性能評(píng)價(jià)：

H、n、fs、k和α的重復(fù)性，或R發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。37當(dāng)前第37頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)38當(dāng)前第38頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)六溴環(huán)十二烷（hexabromocylcododecane,HBCD）是一種用于建筑業(yè)，紡織業(yè)和電子產(chǎn)業(yè)的溴代阻燃劑HBCD有多個(gè)手性中心，六種立體異構(gòu)體，但在化工產(chǎn)品中α，β，γ-HBCD.

β環(huán)糊精手性柱氨基醇類(lèi)藥物：替考拉寧手性柱39當(dāng)前第39頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)5．檢測(cè)系統(tǒng)

（1）檢測(cè)器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測(cè)限低）噪音（noise）低線(xiàn)性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專(zhuān)屬型）（2）主要分類(lèi)紫外光度檢測(cè)器：適用吸收紫外光的吸收熒光檢測(cè)器：只能分析自身發(fā)光的物質(zhì)，靈敏度高；示差折光檢測(cè)器：利用折光率的差別40當(dāng)前第40頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

紫外檢測(cè)器(ultraviolet-visibledetector，UVD)檢測(cè)原理：基于被分析樣品組分對(duì)特定波長(zhǎng)紫外光的選擇性吸收，組分濃度與吸光度的關(guān)系遵守朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律。

響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=㏑I0/I=εbcI0為入射光強(qiáng)度；I為透射光強(qiáng)度；ε摩爾吸光系數(shù)，b為檢測(cè)器光程長(zhǎng)度；c為組分摩爾濃度41當(dāng)前第41頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

應(yīng)用

使用范圍廣，有π鍵和孤對(duì)電子的物質(zhì)，如烯烴、芳烴以及含有C=O

、

C=S、N=O

、N=N基團(tuán)的化合物。

特點(diǎn)：

靈敏度高；線(xiàn)形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

42當(dāng)前第42頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)熒光檢測(cè)器（fluorescencedetector）

在紫外光的激發(fā)下能發(fā)熒光的化合物或能用衍生法制成熒光衍生物的物質(zhì)均可進(jìn)行熒光檢測(cè)。特點(diǎn)：高靈敏度比紫外檢測(cè)器檢測(cè)限高10-10g/ml

高選擇性；對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)；

激發(fā)波長(zhǎng)(ex)和發(fā)射波長(zhǎng)(em)的選擇；如菲、芘和苯并a芘的激發(fā)波長(zhǎng)：280、333和365nm；發(fā)射波長(zhǎng)350、390和410nm

43當(dāng)前第43頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)在食品研究中的分析應(yīng)用食品中的天然成分碳水化合物類(lèi)脂化合物、甘油三酸酯、膽固醇脂肪酸和有機(jī)酸蛋白、肽、氨基酸食品添加劑酸味劑、甜味劑、香精、乳化劑抗氧化劑、防腐劑顏料和染料（色素〕維生素污染物霉菌（黃曲霉毒素〕農(nóng)藥和獸藥殘留多環(huán)芳烴（PAHs〕和亞硝酸11.6高效液相色譜的應(yīng)用44當(dāng)前第44頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)在獸藥研究中分析應(yīng)用在醫(yī)藥研究中分析應(yīng)用

常用藥物研究中的應(yīng)用：解熱鎮(zhèn)痛藥、鎮(zhèn)靜藥、安定藥、心血管藥、磺胺類(lèi)消炎藥等。甾體藥物研究中的應(yīng)用：腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素、雌性激素和孕激素等?？咕仡?lèi)藥物研究中的應(yīng)用：青霉素、頭孢菌素、慶大毒素、四環(huán)素、氯霉素、諾氟沙星等。中草藥研究中的應(yīng)用：生物堿、甙類(lèi)(皂甙、強(qiáng)心甙、黃酮甙等)、萜類(lèi)手性藥物研究中的應(yīng)用：光學(xué)異構(gòu)體的拆分(如解毒劑D-青霉胺毒性小，L-異構(gòu)體毒性很強(qiáng))醫(yī)療藥物的檢測(cè)、新藥研究、藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)研究。

11.6高效液相色譜的應(yīng)用45當(dāng)前第45頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)在生物化學(xué)和生物工程中的應(yīng)用氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的分析研究核堿、核苷、核苷酸和核酸的分析研究生物胺的分析研究（兒茶酚胺類(lèi))在精細(xì)化工分析中的應(yīng)用醇、醛和酮、醚的分離分析酸和酯的分離分析表面活性劑的分析聚合物的分析研究藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等工業(yè)產(chǎn)品在無(wú)機(jī)離子分析中應(yīng)用飲用水、酸雨、土壤中陰離子和陽(yáng)離子分析

11.6高效液相色譜的應(yīng)用46當(dāng)前第46頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)化學(xué)結(jié)構(gòu)極性和穩(wěn)定程度水中和有機(jī)溶劑中溶解度相對(duì)分子質(zhì)量的大小熟悉各種色譜類(lèi)型主要特點(diǎn)應(yīng)用范圍一、盡可能多的了解樣品性質(zhì)11.7高效液相色譜分析方法的建立47當(dāng)前第47頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)色譜分離類(lèi)型選擇48當(dāng)前第48頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)11.7高效液相色譜分析方法的建立二、色譜柱的選擇49當(dāng)前第49頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)三、流動(dòng)相、配比、流量、梯度洗脫的選擇采用梯度洗脫時(shí)，柱在重復(fù)使用前，用泵把幾倍于柱體積的起始溶劑壓經(jīng)柱子，重新建立起始的平衡來(lái)得到柱的再生。50當(dāng)前第50頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)四、樣品組分保留值與容量因子的選擇51當(dāng)前第51頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)四、流動(dòng)相及樣品的制備52當(dāng)前第52頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

流動(dòng)相（1）分類(lèi)：

按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：等度淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。四、流動(dòng)相及樣品的制備53當(dāng)前第53頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)a.反相色譜最常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃最常用的流動(dòng)相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的劇毒性，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動(dòng)相。b.正相色譜常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度的順序是：

正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇最常用的是正已烷，雖然其價(jià)格較貴，但80％的順、反和鄰位、對(duì)位異構(gòu)體仍然要用正相色譜來(lái)進(jìn)行分離。在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。（2）對(duì)流動(dòng)相選擇注意的問(wèn)題及要求54當(dāng)前第54頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)水：

去離子水自動(dòng)純水儀

純凈水商品瓶裝水配置流動(dòng)相水應(yīng)為新鮮水，水質(zhì)要求越高放置時(shí)間越短溶劑：色譜純（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙醇）試劑：分析純?cè)谶x擇溶劑時(shí)，選擇高純度、低粘度溶劑，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加55當(dāng)前第55頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用，

使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。能溶解樣品，但不能與樣品發(fā)生反應(yīng)。與與所用檢測(cè)器相匹配。例如利用紫外檢測(cè)器時(shí)，溶劑要不吸收紫外光。容易精制、純化、毒性小，不易著火、價(jià)格盡量便宜等56當(dāng)前第56頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)57當(dāng)前第57頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)四、流動(dòng)相及樣品的制備58當(dāng)前第58頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)流動(dòng)相前處理——脫氣氣泡對(duì)測(cè)定的影響：泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積；柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形；檢測(cè)器中得氣泡產(chǎn)生基線(xiàn)波動(dòng)59當(dāng)前第59頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（3）流動(dòng)相的保存60當(dāng)前第60頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)五、分析測(cè)定方法的設(shè)定61當(dāng)前第61頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)六、樣品的分析62當(dāng)前第62頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)1.HPLC的日常操作條件溫度10～30℃;相對(duì)濕度≤80％；最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備。11.8高效液相色譜儀的維護(hù)和保養(yǎng)2.進(jìn)樣器的保養(yǎng)

每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，

防止樣品的交叉污染。當(dāng)前第63頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.泵的保養(yǎng)流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣，避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡防止固體微粒進(jìn)入泵體防止溶劑瓶?jī)?nèi)的流動(dòng)相被用完流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì)不超過(guò)規(guī)定的最高壓力進(jìn)液處的沙芯過(guò)濾頭要經(jīng)常清洗64當(dāng)前第64頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)4.柱的保養(yǎng)

（1）柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；

（2）當(dāng)柱子和色譜儀聯(lián)結(jié)時(shí)，閥件或管路一定要清洗干凈；

（3）要注意流動(dòng)相的脫氣；

（4）避免使用高粘度溶劑作為流動(dòng)相；

（5）進(jìn)樣樣品要提純；

（6）嚴(yán)格控制進(jìn)樣量；

（7）每天分析結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；

（8）每天分析結(jié)束后，都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)清洗柱；

（9）若分析柱長(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉；當(dāng)前第65頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)色譜柱清洗與保存66當(dāng)前第66頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)5.檢測(cè)器(UV)的保養(yǎng)（1）紫外燈的保養(yǎng)：在分析前、柱平衡的差不多時(shí)，打開(kāi)檢測(cè)器；在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè)器。

（2）樣品池要保養(yǎng)。當(dāng)前第67頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)6.其它部件維護(hù)與保養(yǎng)68當(dāng)前第68頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)69當(dāng)前第69頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)11.9高效液相色譜分析方法

定性分析方法定量分析方法：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法 同GC70當(dāng)前第70頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)1.外標(biāo)法（一）定量分析方法71當(dāng)前第71頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)以待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。（1）內(nèi)標(biāo)校正曲線(xiàn)法：2.內(nèi)標(biāo)法72當(dāng)前第72頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（2）內(nèi)標(biāo)對(duì)比法（3）校正因子法73當(dāng)前第73頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

(ms)樣品—樣品溶液中內(nèi)標(biāo)物的含量；

(ms)對(duì)照—對(duì)照品溶液中內(nèi)標(biāo)物的含量；

w—平均片重(或丸重)；

m—取樣量；

(Ai/As)樣品—樣品溶液中，待測(cè)物A/內(nèi)標(biāo)物A；

(Ai/As)對(duì)照—對(duì)照品溶液中，待測(cè)物A/內(nèi)標(biāo)物A。74當(dāng)前第74頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)例：

用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定復(fù)方乙酰水楊酸片(APC)中阿司匹林A、非那西汀P、咖啡因C三組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，撲熱息痛S作內(nèi)標(biāo)物。實(shí)驗(yàn)條件：流動(dòng)相：甲醇/三乙醇胺=1/500，流量1mL/min；UV273nm檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表。樣品溶液：稱(chēng)取1片量的藥品粉末0.5005g經(jīng)多次萃取后配制成100mL溶液。wA、wP、wC為樣品中三組分的未知質(zhì)量(g/片)，0.5005g為加入內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量。試用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法求：

⑴每片中A、P和C的含量；⑵每片中A、P和C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

定量分析方法實(shí)例75當(dāng)前第75頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)定量分析方法實(shí)例PASC圖10-17APC的分析被測(cè)溶液所含組分阿司匹林A內(nèi)標(biāo)物S非那西汀P咖啡因C相對(duì)保留時(shí)間/min0.531.001.452.50對(duì)照溶液c0.2200.0350.1500.035A154856171222692272372221樣品溶液cwA0.035wPwCA178024202694820968407792單位：c:g/100mL，A:μV·s76當(dāng)前第76頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)定量分析方法PASC圖18-17APC的分析77當(dāng)前第77頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)定量分析方法PASC圖10-17APC的分析⑵每片中A、P和C的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ωi：78當(dāng)前第78頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)第十二章離子色譜法

Chapter12.ionhromatograph,IC79當(dāng)前第79頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.1離子色譜法12.2離子色譜法原理12.3離子色譜儀特點(diǎn)12.4離子色譜儀組成及應(yīng)用12.5離子色譜儀與高效液相色譜區(qū)別12.6離子色譜的操作與保養(yǎng)80當(dāng)前第80頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.1離子色譜的定義與類(lèi)型定義：狹義而言，離子色譜法是以低交換容量的離子交換樹(shù)脂為固定相對(duì)離子性物質(zhì)進(jìn)行分離，用電導(dǎo)檢測(cè)器連續(xù)檢測(cè)流出物電導(dǎo)變化的一種色譜方法。簡(jiǎn)單的說(shuō)，離子色譜法就是利用被測(cè)物的離子性進(jìn)行分離和檢測(cè)的液相色譜法81當(dāng)前第81頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)

凡是在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可以用離子交換色譜法進(jìn)行分離.

氣相色譜(氣－固分離，流動(dòng)相為載氣)

液相色譜(液－固分離，流動(dòng)相為液體)

ＨＰＬＣ(主要分離弱極性和非極性的有機(jī)化合物)

ＩＣ

(主要分離極性和部分弱極性的化合物)

固定相：離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相：電解質(zhì)溶液檢測(cè)器：電導(dǎo)檢測(cè)器82當(dāng)前第82頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)陽(yáng)離子交換：陰離子交換：離子交換樹(shù)脂上可以離解的離子和流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的可逆交換，根據(jù)這些離子對(duì)交換劑有不同的親和力而被分離。12.2離子色譜法原理

83當(dāng)前第83頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.2離子色譜法原理

離子色譜中發(fā)生的基本過(guò)程就是離子交換，因此，離子色譜本質(zhì)上就是離子交換色譜。離子色譜目標(biāo)物離子型物質(zhì):在水溶液中電離，具有正

或負(fù)電荷的元素。陰離子：Ｃｌ－，ＮＯ2－，ＳＯ４２－，

ＣｒＯ４２－陽(yáng)離子：Ｎａ＋，ＮＨ４＋，Ｃａ２＋，Ｆｅ３＋

84當(dāng)前第84頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.3離子色譜儀特點(diǎn)1.與傳統(tǒng)離子交換的不同：采用交換容量非常低的特制離子交換樹(shù)脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；2.低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制3.可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無(wú)機(jī)離子混合物。

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線(xiàn)檢測(cè)方法。85當(dāng)前第85頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)4.分析速度快

可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣分析；5.經(jīng)過(guò)稀釋、過(guò)濾后可以測(cè)定多種樣品例：使用雙柱法，在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。6.

離子色譜的泵體則采用全塑系統(tǒng)，對(duì)酸、堿、鹽有抗污染的性能。

離子色譜與高效液相色譜區(qū)別詳見(jiàn)12.5多價(jià)態(tài)可氧化元素（NO2-&NO3-,SO32-&SO42-etc.）

不同價(jià)態(tài)離子（Fe3+&Fe2+,

Cr3+&Cr6+etc.）86當(dāng)前第86頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.4離子色譜儀組成87當(dāng)前第87頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)1、離子色譜儀組成88當(dāng)前第88頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)淋洗液

泵色譜柱檢測(cè)器

輸液系統(tǒng)分離檢測(cè)記錄F-NO3-SO42-Cl-NO2-Br-HPO42-進(jìn)樣閥抑制器檢測(cè)池進(jìn)樣2.離子色譜法組成89當(dāng)前第89頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（1）

流動(dòng)相輸運(yùn)系統(tǒng)離子色譜儀器的輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度淋洗裝置等，與高效液相色譜的輸液系統(tǒng)基本相似。（a）儲(chǔ)液罐:存儲(chǔ)流動(dòng)相離子的流動(dòng)相一般是酸、堿、鹽或絡(luò)合物的水溶液，因此貯液系統(tǒng)一般是以玻璃或聚四氟乙烯為材料；溶劑使用前必須脫氣。（b）高壓輸液泵高效液相色譜采用不銹鋼或欽合金材料，與高效液相色譜相比，離子色譜的泵體則采用全塑系統(tǒng)，從而對(duì)酸、堿、鹽有抗污染的性能，并保證了對(duì)金屬離子測(cè)定的準(zhǔn)確性。

(c)梯度淋洗裝置類(lèi)似氣相色譜中的程序升溫。分為：低壓梯度和高壓梯度。90當(dāng)前第90頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（2）進(jìn)樣系統(tǒng)類(lèi)似HPLC（3）分離系統(tǒng)離子色譜是一種液-固色譜，為高效液相色譜的一種，但柱填料和分離機(jī)理有其自身特點(diǎn)：離子色譜柱填料的粒度一般在5～25μm之間，比高效液相色譜的柱填料略大，因此其壓力比高效液相色譜的要?。恢盍弦话銥椋焊叻肿泳酆衔锖凸枘z型離子色譜填料

一般分析柱內(nèi)徑為4mm，長(zhǎng)度為100～250mm，柱子兩頭采用緊固螺絲。高檔儀器特別是陽(yáng)離子色譜柱一般采用聚四氟乙烯材料。91當(dāng)前第91頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（4）抑制系統(tǒng)抑制器作用：安裝在電導(dǎo)池之前降低背景電導(dǎo)(淋洗液)

被測(cè)物的濃度小于流動(dòng)相電解質(zhì)的濃度,這樣難以測(cè)量由于樣品離子的存在而產(chǎn)生微弱電導(dǎo)的變化。提高待測(cè)離子的電導(dǎo)率和靈敏度92當(dāng)前第92頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)抑制器的作用廢液BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)NaF,NaCl,NaNO3Na2HPO4,Na2SO4～～RetentiontimeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4BackGround：Na2CO3/NaHCO3

(700μS)～～RetentiontimeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4RetentiontimeBackGround：H2CO3(15μS)Conductivity93當(dāng)前第93頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)（5）電導(dǎo)檢測(cè)器

測(cè)定溶液流過(guò)電導(dǎo)池電極時(shí)的電導(dǎo)率可檢測(cè)大部分離子型化合物溶液至檢測(cè)池電極

檢測(cè)池離子色譜常用檢測(cè)器

電導(dǎo)檢測(cè)器；紫外—可見(jiàn)光光度檢測(cè)器；熒光光度檢測(cè)器；安培檢測(cè)器。94當(dāng)前第94頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.離子色譜的應(yīng)用電力冷卻水/HPW

鍋爐蒸汽中的雜質(zhì)食品/飲料酒/飲料/糖果

飲料中有機(jī)酸造紙./紙漿

紙漿液?處理水

張紙和液體中的離子農(nóng)業(yè)肥料/土壤/植物/等

土壤中離子醫(yī)學(xué)血液/尿

尿中草酸化妝品化妝品/清潔劑/洗發(fā)液

化妝品液體中的陰離子制藥化學(xué)/液體

化學(xué)品中的重金屬領(lǐng)域環(huán)境./污染雨水/河水/大氣/污水

雨水中離子城市用水自來(lái)水/水源

自來(lái)水中消毒副產(chǎn)物樣品應(yīng)用化學(xué)品設(shè)備提取物/聚合物

環(huán)氧類(lèi)粘合劑中的陰離子電子/半導(dǎo)體

高純水?晶片沖洗水

高純水中的離子型雜質(zhì)金屬/鋼材表面處理液?鍍槽?冷卻水

電鍍槽中的抗壞血酸

95當(dāng)前第95頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)2.離子色譜的應(yīng)用

陰離子分析:

雙柱；薄殼型陰離子交換樹(shù)脂分離柱(3×250mm),

流動(dòng)相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50ppm。96當(dāng)前第96頁(yè)\共有103頁(yè)\編于星期五\23點(diǎn)12.5離子色譜與液相色譜區(qū)別離子色譜液相色譜氣路系統(tǒng)對(duì)用NaOH流動(dòng)相，用于保護(hù)流動(dòng)相以免同空氣接觸。一般無(wú)流路系統(tǒng)全peek材料，耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿特殊金屬材料為主，耐有機(jī)溶劑，不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿流動(dòng)相以強(qiáng)酸強(qiáng)堿為主以有機(jī)溶劑為主，可以和其它鹽或水聯(lián)用試劑要求對(duì)去離子水要求極高，大于17.8mΩ,成本很高。有機(jī)試劑也要考慮離子雜質(zhì)，至少HPLC級(jí)。水要求相對(duì)較低，大于10mΩ，成本