第十四章高效液相色譜法演示文稿

第十四章高效液相色譜法演示文稿當(dāng)前第1頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)優(yōu)選第十四章高效液相色譜法當(dāng)前第2頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)概述概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀(jì)60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線(xiàn)檢測(cè)器，從而發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學(xué)和技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分離分析手段。特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。當(dāng)前第3頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜比較經(jīng)典液相色譜高效液相色譜常壓或減壓高壓，40～50MPa填料顆粒大填料顆粒小，2～50μm柱效低柱效高,40000～60000塊/m分析速度慢分析速度快色譜柱只用一次色譜柱可重復(fù)多次使用不能在線(xiàn)檢測(cè)能在線(xiàn)檢測(cè)HPLC:采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測(cè)器HPLC特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便

當(dāng)前第4頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)氣相色譜高效液相色譜只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析20%的化合物幾乎可以分析各種物質(zhì)不能分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)可以分析熱不穩(wěn)定物質(zhì)用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效色譜柱不能很長(zhǎng)，柱效不會(huì)很高有很靈敏的檢測(cè)器如ECD和較靈敏的通用檢測(cè)器(FID和TCD)沒(méi)有較高靈敏的通用檢測(cè)器流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理流動(dòng)相有毒，費(fèi)用較高運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作比GC難一些儀器制造難度較小儀器制造難度大高效液相色譜與氣相色譜比較5當(dāng)前第5頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)高效液相色譜法的分類(lèi)根據(jù)分離機(jī)理液-液分配色譜化學(xué)鍵合相色譜液-固吸附色譜離子交換色譜離子色譜離子對(duì)色譜尺寸排阻色譜親和色譜需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機(jī)理，但可能還存在次要的其他機(jī)理。

根據(jù)固定相分類(lèi)液-液色譜液-固色譜6當(dāng)前第6頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)根據(jù)固定相和液體流動(dòng)相相對(duì)極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動(dòng)相和固定相的相對(duì)極性，（反相：流動(dòng)相的極性大于固定相；正相：流動(dòng)相的極性小于固定相）。最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于其他各種色譜方法。正相色譜和反相色譜7當(dāng)前第7頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)高效液相色譜儀1.儲(chǔ)液瓶（輸液管入口端安裝有過(guò)濾器）；2.高壓輸液泵；3.混合器和阻尼器；4.進(jìn)樣器（閥）；5.色譜柱；6.檢測(cè)器；7.廢液瓶；8.數(shù)據(jù)處理和控制系統(tǒng)8當(dāng)前第8頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個(gè)流動(dòng)相儲(chǔ)液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個(gè)儲(chǔ)瓶容積500~2000mL。儲(chǔ)液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動(dòng)時(shí)易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過(guò)放空閥排出。儲(chǔ)器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測(cè)器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲(chǔ)液器的溶劑導(dǎo)管入口處裝有過(guò)濾器，以進(jìn)一步除去溶劑中灰塵或微粒殘?jiān)?，防止損壞泵、進(jìn)樣閥或堵塞色譜柱。流動(dòng)相貯器和溶劑處理系統(tǒng)9當(dāng)前第9頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)高壓輸液系統(tǒng)儲(chǔ)液罐高壓輸液泵

要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)流量范圍寬，耐腐蝕分類(lèi)：恒流泵（機(jī)械泵）

恒壓泵過(guò)濾器壓力脈動(dòng)阻力器機(jī)械注射泵機(jī)械往復(fù)泵多用于流量要求在1-50L/min范圍的微型HPLC或毛細(xì)管柱HPLC中活塞泵隔膜泵10當(dāng)前第10頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱(chēng)柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。進(jìn)樣閥進(jìn)樣系統(tǒng)11當(dāng)前第11頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)12高壓進(jìn)樣閥（六通閥）進(jìn)樣裝置隔膜注射進(jìn)樣器

色譜柱頂端裝入耐壓彈性隔膜，進(jìn)樣時(shí)用微量注射器刺穿隔膜將試樣注入色譜柱。當(dāng)前第12頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離柱的性能不受影響。分離系統(tǒng)色譜柱13當(dāng)前第13頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)1.色譜柱類(lèi)型

按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類(lèi)型。高效液相色譜柱2.保護(hù)柱

一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長(zhǎng)使用壽命。3.柱恒溫器

對(duì)色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。14當(dāng)前第14頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

在液相色譜中，有兩種基本類(lèi)型的檢測(cè)器。

一類(lèi)是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。

另一類(lèi)是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類(lèi)檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等。檢測(cè)系統(tǒng)15當(dāng)前第15頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

l.光吸收檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器，光二極管陣列檢測(cè)器，紅外吸收檢測(cè)器2.熒光檢測(cè)器

3.示差折光率檢測(cè)器4.電化學(xué)檢測(cè)器5.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器6.質(zhì)譜檢測(cè)器液相色譜檢測(cè)器16當(dāng)前第16頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)1.紫外吸收(UV)檢測(cè)器

應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

特點(diǎn)：靈敏度高；線(xiàn)形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感；波長(zhǎng)可選，易于操作；可用于梯度洗脫。光吸收檢測(cè)器

17當(dāng)前第17頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)2.紫外光電二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展；光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。18當(dāng)前第18頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)20.2.5.1.光吸收檢測(cè)器2.紫外光電二極管陣列檢測(cè)器19當(dāng)前第19頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)20.2.5.1.光吸收檢測(cè)器2.紫外光電二極管陣列檢測(cè)器20當(dāng)前第20頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)紫外普通檢測(cè)器和光電二極管陣列檢測(cè)器的比較普通檢測(cè)器光電二極管陣列檢測(cè)器21當(dāng)前第21頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)3.紅外吸收檢測(cè)器

與一般光吸收檢測(cè)器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過(guò)吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測(cè)器可提供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動(dòng)相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。光吸收檢測(cè)器22當(dāng)前第22頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

高靈敏度、高選擇性

對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)。熒光檢測(cè)器(FluorescenceDetector，F(xiàn)D)23當(dāng)前第23頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；

可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種。示差折光檢測(cè)器（DifferentialRefrativeIndexDetector,RI）24當(dāng)前第24頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)電化學(xué)檢測(cè)器

基于電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，主要有安培、極譜及電導(dǎo)等幾種類(lèi)型，適用于測(cè)定具有電化學(xué)氧化還原性質(zhì)及電導(dǎo)的化合物，如含硝基、氨基等有機(jī)化合物及無(wú)機(jī)陰、陽(yáng)離子等。1.氟塑料池體,2.工作電極,3.氟塑料或聚酯墊片,4.接參比電極，至廢液，5.接色譜柱。25當(dāng)前第25頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(EvaporationLightScatteringDetector,ELSD)1.色譜柱出口;2.液壓釋放口;3.氮?dú)馊肟?4.霧化器;5.加熱漂移管;6.樣品液滴;7.激光光源;8.排氣口;9.光電檢測(cè)器;10.放大器;11.連接記錄系統(tǒng)。A.色譜柱洗出液霧化區(qū)；B.溶劑蒸發(fā)區(qū);C.樣品粒子光散射。26當(dāng)前第26頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)質(zhì)譜檢測(cè)器（Massspectrometrydetector,MSD)27是一種靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，能提供分子結(jié)構(gòu)信息，是非常理想的檢測(cè)器。它作為一種質(zhì)量型檢測(cè)器在近年有較大的發(fā)展，其中以分析生物大分子的生物制品發(fā)展尤為迅速。①分析范圍廣，MS幾乎可以檢測(cè)所有的化合物，比較容易地解決了分析熱不穩(wěn)定化合物的難題；②分離能力強(qiáng)，即使被分析混合物在色譜上沒(méi)有完全分離開(kāi)，但通過(guò)MS的特征離子質(zhì)量色譜圖也能分別給出它們各自的色譜圖來(lái)進(jìn)行定性定量；③定性分析結(jié)果可靠，可以同時(shí)給出每一個(gè)組分的分子量和豐富的結(jié)構(gòu)信息；④檢測(cè)限低，MS具備高靈敏度，通過(guò)選擇離子檢測(cè)（SIM）方式，其檢測(cè)能力還可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上；⑤分析時(shí)間快，HPLC-MS使用的液相色譜柱為窄徑柱，縮短了分析時(shí)間，提高了分離效果；⑥自動(dòng)化程度高，HPLC-MS具有高度的自動(dòng)化。當(dāng)前第27頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)附屬系統(tǒng)脫氣梯度淋洗預(yù)飽和柱和預(yù)柱恒溫自動(dòng)進(jìn)樣餾分收集數(shù)據(jù)處理28當(dāng)前第28頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)29梯度淋洗(gradientelution)

梯度淋洗是指在分離過(guò)程中使流動(dòng)相的組成隨時(shí)間改變而改變。通過(guò)連續(xù)改變色譜柱中流動(dòng)相的極性、離子強(qiáng)度或pH等因素，使被測(cè)組分的相對(duì)保留值得以改變，提高分離效率。梯度淋洗對(duì)于一些組分復(fù)雜及容量因子值范圍很寬的樣品分離尤為必要。HPLC中的梯度淋洗的作用十分類(lèi)似于氣相色譜中的程序升溫，兩者的目的都是為了使樣品的組分在最佳容量因子值范圍流出柱子，使保留時(shí)間過(guò)短而擁擠不堪、峰形重疊的組分或保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、峰形扁平、寬大的組分，都能獲得良好的分離。梯度淋洗的優(yōu)點(diǎn)：可以改進(jìn)復(fù)雜樣品的分離，改善峰形，減少拖尾并縮短分離時(shí)間。另外，由于滯留組分全部流出柱子，可保持柱性能長(zhǎng)期良好。當(dāng)前第29頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類(lèi)，可分為剛性固體和硬膠兩大類(lèi)。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類(lèi)，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類(lèi)。

高效液相色譜固定相和流動(dòng)相30當(dāng)前第30頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：1.化學(xué)惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。2.適用的物理性質(zhì)，包括沸點(diǎn)較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無(wú)紫外吸收等，以降低UV檢測(cè)器本低響應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度;對(duì)樣品具有適當(dāng)溶解能力等。3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)廉等，便于操作和安全。

流動(dòng)相31當(dāng)前第31頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)1.溶劑強(qiáng)度參數(shù)ε0定義為溶劑分子在單位吸附劑表面積上的吸附自由能，表征溶劑分子對(duì)吸附劑的親和力大小。2.溶解度參數(shù)δ它是溶劑與溶質(zhì)分子間各種作用力的總和，包括色散力、偶極作用力、接受質(zhì)子能力、給于質(zhì)子能力等。3.極性參數(shù)P’表示每種溶劑與乙醇、二氧六環(huán)和硝基甲烷三種極性物質(zhì)相互作用力的度量，類(lèi)似于氣相色譜固定液的Rohrschneider常數(shù)，反映溶劑接受質(zhì)子、給出質(zhì)子和偶極相互作用能力及選擇性差異，亦作為表征溶劑洗脫強(qiáng)度的指標(biāo)。

流動(dòng)相溶劑的特性參數(shù)32當(dāng)前第32頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)33當(dāng)前第33頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

優(yōu)化保留值k和分離選擇性α的重要方法是改變流動(dòng)相溶劑類(lèi)型和組成。溶劑組成優(yōu)化用差試法比較麻煩、費(fèi)時(shí)，成功率不一定很高。采用溶劑組成與溶劑強(qiáng)度參數(shù)關(guān)系的估算,可減少優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作。二元混合溶劑極性參數(shù)P’與其體積組成呈線(xiàn)性關(guān)系，可按算數(shù)平均值求出。例如溶劑A和B混合物的極性參數(shù)PAB’可按下式求出:34混合溶劑ФA與ФB分別表示溶劑A和溶劑B在混合溶劑中的體積分?jǐn)?shù)。當(dāng)前第34頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)高效液相色譜法的主要類(lèi)型根據(jù)分離機(jī)制不同，可分為以下幾種類(lèi)型：分配色譜法，包括液-液分配色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法；液-固吸附色譜法；離子交換色譜法；尺寸排阻色譜法；親和色譜法。35當(dāng)前第35頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類(lèi)型?？煞譃橐?液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類(lèi)型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。化學(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的分配色譜類(lèi)型。分配色譜(PartitionChromatography)36當(dāng)前第36頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)液-液分配色譜(LLPC)固定相載體和固定液（常選用幾種極性不同的固定液）流動(dòng)相要求：對(duì)固定相的溶解度盡可能小分類(lèi)正相分配色譜流動(dòng)相的極性<固定相的極性適用于極性化合物的分離反相分配色譜流動(dòng)相的極性>固定相的極性適用于非極性化合物的分離分離原理：與液液萃取相同。37當(dāng)前第37頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)化學(xué)鍵合相色譜(CBPC)鍵合固定相類(lèi)型

利用硅膠表面的硅羥基與有機(jī)分子疏水基團(tuán)極性基團(tuán)離子交換基團(tuán)鍵合相的鍵型硅酸酯型(SiOR)適用于不含水或醇的流動(dòng)相；硅氮型(SiN)或硅碳型(SiC)可用于非極性或強(qiáng)極性的溶劑作流動(dòng)相，當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在48范圍內(nèi)；硅烷化(SiOSiC)型具有熱穩(wěn)定性好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑，能在70C以下，pH在28范圍內(nèi)正常工作。38采用化學(xué)鍵合相的液相色譜，由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類(lèi)繁多樣品的分離。當(dāng)前第38頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)反相鍵合相色譜法固定相：非極性鍵合固定相流動(dòng)相：極性較強(qiáng)的溶劑正相鍵合相色譜法固定相：極性鍵合固定相流動(dòng)相：比鍵合相極性小的非極性或弱極性有機(jī)溶劑離子性鍵合相色譜法固定相：以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)流動(dòng)相：一般為緩沖溶液優(yōu)點(diǎn):改變流動(dòng)相的組成和種類(lèi)，可有效分離各種類(lèi)型化合物（極性、非極性和離子型），適合于梯度淋洗。缺點(diǎn)：不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系39當(dāng)前第39頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)樣品種類(lèi)鍵合基團(tuán)流動(dòng)相色譜類(lèi)型實(shí)例低極性溶解于烴類(lèi)C18甲醇-水乙腈-水乙腈-四氫呋喃反相多環(huán)芳烴甘油三脂、類(lèi)脂、脂溶性維生素甾族化合物、氫醌中等極性可溶于醇CNNH2乙腈、正己烷氯仿正己烷異丙醇正相脂溶性維生素、甾族、芳香醇、胺、類(lèi)脂止痛藥芳香胺、脂、氯化農(nóng)藥、苯二甲酸C18C8CN甲醇、水乙腈反相甾族、可溶于醇的天然產(chǎn)物維生素、芳香酸、黃嘌呤高極性可溶于水C8CN甲醇、乙腈水、緩沖溶液反相水溶性維生素、胺、芳醇抗菌素、止痛藥C18水、甲醇、乙腈反相離子對(duì)酸、磺酸類(lèi)染料、兒茶酚胺SO3-水和緩沖溶液陽(yáng)離子交換無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、氨基酸NR3+磷酸緩沖液陰離子交換核苷酸、糖、無(wú)機(jī)陰離子、有機(jī)酸化學(xué)鍵合固定相的選擇當(dāng)前第40頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)液-固吸附色譜法(LiquidSolidAdsorptionChromatography，LSAC)液固吸附色譜固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線(xiàn)性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小。孔穴淺的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。41以固定吸附劑作為固定相，根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同而進(jìn)行分離。當(dāng)前第41頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)42洗脫劑的選擇：相似相溶極性大的試樣用極性強(qiáng)的洗脫劑，極性弱的試樣用極性弱的洗脫劑液固吸附色譜流動(dòng)相吸附色譜分離機(jī)理當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分子，于是，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，吸附平衡常數(shù)大的組分在吸附劑上的保留強(qiáng)，難于洗脫，后被分離出來(lái)。

當(dāng)前第42頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。離子交換色譜法43當(dāng)前第43頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：

陰離子交換：

離子交換原理44陽(yáng)離子交換：當(dāng)前第44頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

這里，[XR]s、[YR]s和[X]m、[Y]m分別代表X、Y在固定相上和流動(dòng)相中濃度。色譜過(guò)程分布平衡常數(shù)為溶質(zhì)X在固定相和流動(dòng)相濃度之比，上式重排得:離子交換平衡45當(dāng)前第45頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

設(shè)色譜柱內(nèi)離子交換劑的質(zhì)量是WS，則固定相上溶質(zhì)的量(mol或g)為[XR]SWS;柱內(nèi)流動(dòng)相體積Vm,溶質(zhì)量為[X]mVm。溶質(zhì)色譜保留值k為:

對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，一價(jià)離子的KEX值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋?/p>

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+對(duì)于季銨型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋篊lO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－離子交換平衡46KEX值越大表示待測(cè)離子對(duì)樹(shù)脂的親和力越大，交換能力越大，越易保留而難于洗脫。當(dāng)前第46頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)離子交換固定相主要可分為以下幾種類(lèi)型:多孔型離子交換樹(shù)脂；薄膜型離子交換樹(shù)脂；表面多孔型離子交換樹(shù)脂；離子交換鍵合固定相。離子交換色譜流動(dòng)相具有其他色譜方法相同的要求，即必須溶解樣品，有合適溶劑強(qiáng)度以獲得合理的保留時(shí)間和k值，和各溶質(zhì)有差異的相互作用以改進(jìn)分離選擇性α。離子交換色譜流動(dòng)相是含離子水溶液，常是緩沖劑溶液。流動(dòng)相緩沖液的類(lèi)型、離子強(qiáng)度、pH值及添加有機(jī)溶劑類(lèi)型、濃度等是實(shí)現(xiàn)分離條件優(yōu)化的主要因素。離子交換色譜固定相和流動(dòng)相47當(dāng)前第47頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)。為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱(chēng)為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分離往后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：

離子色譜法(IonChromatography，IC)48當(dāng)前第48頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2．6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱(chēng)為抑制型離子色譜或稱(chēng)雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱(chēng)為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。離子色譜法(IonChromatography，IC)49當(dāng)前第49頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)離子對(duì)色譜法(Ion-PairChromatography)

在色譜體系中引入一種與樣品溶質(zhì)離子電荷相反的離子對(duì)試劑，通常稱(chēng)為對(duì)離子或反離子(counterion)，它與溶質(zhì)離子形成離子對(duì)，從而改變?nèi)苜|(zhì)在兩相中的分配，使離子性溶質(zhì)的保留行為和分離選擇性發(fā)生顯著變化。常用的離子對(duì)試劑有提供陰離子的C4-C8烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、羧酸鹽、萘磺酸鹽、高氯酸鹽等;提供陽(yáng)離子的季銨鹽和烴基胺，如四丁基銨鹽、十六烷基三甲基銨鹽、三乙胺等。將離子對(duì)試劑涂漬在液液色譜的硅膠載體上或溶于流動(dòng)相中，可構(gòu)成液液離子對(duì)分配色譜，由于固定相的流失，這類(lèi)離子對(duì)色譜應(yīng)用不多。在反相色譜中，離子對(duì)試劑加入緩沖液和甲醇、乙腈等極性有機(jī)溶劑的流動(dòng)相構(gòu)成反相離子對(duì)色譜。50當(dāng)前第50頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)

手性高效液相色譜可分為手性固定相(chiralstationaryphase，CSP)/非手性流動(dòng)相和非手性固定相/含手性選擇劑流動(dòng)相，即手性流動(dòng)相兩種色譜技術(shù)。具實(shí)用價(jià)值手性流動(dòng)相添加劑品種較少，這里主要介紹前者。采用手性固定相CSP的高效液相色譜體系的流動(dòng)相與一般分配色譜相似，根據(jù)CSP與流動(dòng)相相對(duì)極性不同可構(gòu)成正相或反相色譜，其中采用極性水溶性流動(dòng)相的反相手性色譜應(yīng)用較多。手性色譜法(Chiralchromatohgaphy)51當(dāng)前第51頁(yè)\共有56頁(yè)\編于星期六\8點(diǎn)1.給體-受體手性固定相