感染的實驗診斷課件

感染的實驗診斷（優(yōu)選）感染的實驗診斷HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白基質(zhì)衣殼核衣殼表面糖蛋白跨膜糖蛋白蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶HIV結(jié)構(gòu)基因,有3個env(核苷酸5781--8360)編碼包膜蛋白p160、120、41等。gag(核苷酸310--1860)編碼病毒核心/衣殼蛋白p55、24、15、17；pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；HIV調(diào)節(jié)基因,有6個tat:上調(diào)mRNA,促病毒復(fù)制-啟動rev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)vif:增強(qiáng)出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子nef:下調(diào)mRNA,抑病毒復(fù)制-制動vpu:僅見于HIV-1,功能不詳；vpx:僅見于HIV-2,功能不詳。5days腦部：巨嗜細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞淋巴系統(tǒng):胸腺淋巴結(jié)脾臟腸道：嗜鉻細(xì)胞前列腺精液陰道黏液骨髓肺胞巨嗜細(xì)胞血液細(xì)胞積存:CD4+T淋巴細(xì)胞巨嗜細(xì)胞膠質(zhì)細(xì)胞嗜鉻細(xì)胞Imagefrom:KahnandWalker,M.D.NEJM1998,Volume339:33-39

July2感染HIV后的血清學(xué)變化HIVRNA濃度p24AgP24AgAnti-gp41,120,160Anti-p24,55感染1周2周6周12周8－10年急性期潛伏期艾滋病期檢出線小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。pol(核苷酸1629--4673)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)、p66、51、32、11等；第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學(xué)方法診斷。Imagefrom:KahnandWalker,M.陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)染個體所占比例。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標(biāo)記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目?；蚣訇幮裕?，是靈敏度和特異性的綜合指標(biāo)，反映了該試驗的25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進(jìn)展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。陽性預(yù)測值=————————100%陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感特異性不夠強(qiáng)，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進(jìn)展:>10y:(2%)HIV-1早期感染病毒標(biāo)志物的動態(tài)觀察HIVRNAHIVp24antigenHIVantibodies窗口期血漿RNAP24前病毒DNAHIV抗體:ELISAHIV抗體:WBHIV感染者的三種臨床轉(zhuǎn)歸VirusCD4CD8aHIVCD4CD4CD8CD8aHIVVirusVirus典型8－10y快速:4-5y:(2%)緩慢/長期不進(jìn)展:>10y:(2%)二、HIV酶聯(lián)篩查檢測方法和試劑※感染急性期，

窗口期※檢測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點(diǎn)免疫膠體金和免疫層析。※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少?！奈宕嘎?lián)試劑的差異和使用策略：三代成熟質(zhì)量穩(wěn)定，窗口期20d;四代提前4－9d，質(zhì)量不穩(wěn)定，用于血站急性感染的檢測?！Y查試驗和確認(rèn)試驗的差異：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認(rèn)試驗，四代試劑敏感性更高，確認(rèn)陰性的不一定是真陰性。

（一）HIV抗體ELISA檢測試劑（血液）第三代：雙抗原夾心法，可檢測所有類型抗體，由于能檢出IgM抗體，縮短了窗口期，有報道說較第二代產(chǎn)品平均可提前5天作出診斷。第四代：雙抗原（抗體）夾心法，將HIVP24抗體和HIV抗原同時包被，再加入待檢血清，最后加入酶標(biāo)記的HIV抗原和HIVP24單克隆抗體，同時檢測血清中的HIVP24抗原和HIV抗體。第五代：HIV抗體和P24抗原實現(xiàn)分別檢測，真正實現(xiàn)早期診斷。FourthGenerationThirdGenerationSecondGenerationIgMIgG各種HIV檢測方法平均窗口期方法 平均天數(shù)第2代EIA 45第3代EIA 22P24抗原 16HIVRNA 11（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標(biāo)靈敏度診斷試驗的靈敏度有兩個不同意義：1．代表一個試驗?zāi)軝z測最少量被分析物（如抗體）的能力。通常可對陽性血清進(jìn)行稀釋以確認(rèn)哪個試驗更敏感。2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。一個試驗有可能檢出很少量的某抗體，但也可因試驗中缺少適當(dāng)?shù)目乖┑粢恍╆栃詷悠贰?．特異性指某試驗正確鑒定所有陰性的能力（無假陽性）。大部分HIV篩查試驗不是100%特異，可用公式計算真陰性特異度=————————100%

真陰性+假陽性注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。如100份血清，5份真陽性，95份真陰性，與參考試驗比較，某試驗檢出6份陽性（一份假陽性），則

特異性=94/(94+1)×100%=98.9%3．試驗效率指某試驗正確鑒定所有陽性和陰性的總體能力（無假陽性或假陰性），是靈敏度和特異性的綜合指標(biāo)，反映了該試驗的總的效率。真陽性+真陰性試驗效率=—————————————100%

真陽性+假陽性+真陰性+假陰性注:公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰性，1份假陽性，1份假陰性，因此

4+94

試驗效率=————————100%=98%4+1+94+14．預(yù)測值預(yù)測值與以上的參數(shù)不同，它描述的是考慮了被檢人群中感染的流行因素后的試驗評價。陽性預(yù)測值（PPV）：定義為在所有陽性結(jié)果人群中感染個體所占比例。陰性預(yù)測值（NPV）：定義為在所有陰性結(jié)果人群中未感染個體所占比例。真陽性陽性預(yù)測值=————————100%

真陽性+假陽性真陰性陰性預(yù)測值=————————100%

真陰性+假陰性注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。⑴在感染流行率較高（5%）的人群中1000人受檢：50份真陽性（已感染），950份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=45/(45+5)×100%=90%NPV=945/(945+5)×100%=99.5%

在另一人群有相同的結(jié)果（即相同數(shù)量的假陽性和假陰性）⑵在感染流行率較低的人群（0.7%）中

1000人受檢：7份真陽性（已感染），993份真陰性（未感染），5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算

PPV=2/2+5=28.6%NPV=988/988+5=99.5%

5．艾滋病病原診斷中的幾個問題⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV血清學(xué)檢測方法可分初篩和確證兩類。HIV初篩試驗特異性不夠強(qiáng)，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復(fù)試驗，若仍為陽性再用確證試驗（WestBlot）去證實。但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標(biāo)準(zhǔn)），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標(biāo)本被視為不確定。出現(xiàn)不確定結(jié)果時，可能是HIV早期感染或是非特異反應(yīng)，應(yīng)在1-6個月后復(fù)查，并結(jié)合個體的臨床表現(xiàn)、感染因素、WB帶型等綜合分析后做出結(jié)論。⑵針對HIV感染不同時期選用不同的檢測手段：HIV感染后兩周內(nèi)，無法查到抗體。兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。6-8周后抗體產(chǎn)生時，進(jìn)行抗體檢測。診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學(xué)方法診斷。

⑶HIV抗體測定的預(yù)測值：試劑的敏感性和特異性可衡量優(yōu)劣，但不能完全決定一個測定結(jié)果正確與否的可能性大小，與預(yù)測值關(guān)系更大。預(yù)測值除與試劑好壞有關(guān)外，還取決于測定對象本身患病率的高低。由表1可以看出：在用ELISA法對高危人群檢測時，其陽性預(yù)測值為99.98%，而在非高危人群中，陽性預(yù)測值僅為18.94%（即查出陽性結(jié)果是真陽性的機(jī)率只有18.94%），反之陰性結(jié)果的機(jī)率為99.997%。

2、免疫標(biāo)志物：CD4/CD8,CTL,微球蛋白和Neopterin等。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進(jìn)展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。HIVantibodies注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。特異度=————————100%兩周后出現(xiàn)病毒血癥，可用P24抗原檢測方法或測逆轉(zhuǎn)錄酶活性。5×10～5×102如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進(jìn)行實驗診斷。表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值PPV=2/2+5=28.NPV=945/(945+5)×100%=99.※ELISA試劑為HIV1/2型，包括M和O組，N組不包括但很少。自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學(xué)方法診斷。HIVantibodies3、核酸定性：DNA－PCR或RT-PCR，陽性不能單獨(dú)用于感染的診斷，陰性不排除感染。感染HIV后的血清學(xué)變化真陽性+真陰性5份假陽性（試驗結(jié)果），5份假陰性（試驗結(jié)果），計算自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值

人群

預(yù)示值(%)

陽性陰性舊金山同性戀人群

99.9880.06美國非高危人群

18.9499.997⑷HIV抗體檢測反應(yīng)強(qiáng)度與HIV感染的概率：ELISA法可根據(jù)光密度（OD）值的強(qiáng)度直接確定。反應(yīng)越強(qiáng)的血清，含有HIV抗體的可能性就越大。表2中正常獻(xiàn)血員（感染率30/10萬），中等強(qiáng)度反應(yīng)時，HIV抗體陽性概率僅為1%，高強(qiáng)度反應(yīng)時，則為86.1%。見表2。不僅要看陰陽結(jié)果，還要看反應(yīng)強(qiáng)度或S/CO比值。表2HIV感染機(jī)率與ELISA反應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)系

人群HIV感染率（/10萬）

ELISA反應(yīng)強(qiáng)度（%）低度中度高度非高危獻(xiàn)血員

300.00071.1386.1高危獻(xiàn)血員

950.00223.4895.2軍人

1500.00365.3996.9吸毒者

450001.9196.699.9注：1、數(shù)字表示相應(yīng)強(qiáng)度反應(yīng)的血清中含有HIV抗體的概率2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。三、確認(rèn)試驗WB為主，還有：線性免疫試驗（LIA）,放射免疫沉淀試驗（RIPA）和免疫熒光試驗（IFA）。WB存有培養(yǎng)病毒的宿主細(xì)胞成分，容易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)造成不確定結(jié)果，LIA使用重組蛋白（多肽），非特異性大大減少，試劑盒有INNO-LIA,Pepti-Lav等。IFA很少使用。（一）、HIV抗體強(qiáng)度與抗體帶型的關(guān)系抗體帶型<11～55～1010～15>15全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型11151642106721224612合計121812049（二）、HIV病毒載量與抗體帶型的關(guān)系載量帶型5×10～5×102

5×102～103

103～104

104～105

>105全帶型8條帶型6條帶型5條帶型4條帶型3條帶型2條帶型1條帶型4118171412166331211183322合計69797818但一些非感染者的血液也會對某些抗原顯示反應(yīng)（出現(xiàn)的條帶不夠判為陽性的標(biāo)準(zhǔn)），在正常的非感染者人群中發(fā)生比例<15%，所以如果用WB來測ELISA陰性者的血清，有些標(biāo)本被視為不確定。vif:增強(qiáng)出芽,釋放新病毒顆粒-感染因子（二）、檢測試劑的質(zhì)量指標(biāo)陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。NPV=945/(945+5)×100%=99.（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)HIVantibodiesrev:調(diào)節(jié)病毒mRNA-開關(guān)注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。HIV-1早期感染病毒標(biāo)志物的動態(tài)觀察注：公式中真陰性指試驗中所能檢測的真陰性數(shù)。⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：酶聯(lián)試驗敏感性高于確認(rèn)試驗，四代試劑敏感性更高，確認(rèn)陰性的不一定是真陰性。在以上例子中，檢測100份血清，5份真陽性，95份真陰驗出現(xiàn)陽性結(jié)果時，應(yīng)再重復(fù)試驗，若仍為陽性再用確證小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理。特異性不夠強(qiáng)，有時會造成一些假陽性結(jié)果，故在初篩試tat:上調(diào)mRNA,促病毒復(fù)制-啟動注：公式中真陽性和真陰性指試驗數(shù)目。5．艾滋病病原診斷中的幾個問題（三）、造成WB假陽性或不確定的原因1.實驗室操作中，陰性樣本被污染或洗滌不徹底。2.HIV感染急性期，窗口期附近，僅顯示gp160或120，或P24，P31，P55帶；此時ELISA往往已顯示陽性反應(yīng)

3.晚期AIDS病人，部分抗體如P24，P31丟失4.其他病毒感染的交叉反應(yīng)，如風(fēng)疹，麻疹，腮腺炎等5.自身免疫病，高丙種球蛋白血癥（全身性紅斑狼瘡）6.腎衰竭和血透析7.遺傳性胰腺囊腫8.多次懷孕或輸血9.肝病10.乙肝、狂犬等疫苗注射，使用胸腺肽。11.線粒體核酸和T細(xì)胞白細(xì)胞抗原引起的抗體在無高危行為的獻(xiàn)血和孕婦人群中，WB不確定率10-15%，甚至高達(dá)32％.Gag蛋白抗體條帶最常見。ELISA篩查陽性結(jié)果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.7%。我國，125份確認(rèn)為HIV-1抗體陽性;條帶出現(xiàn)百分率為：gp160、p24為100%,gp120、gp41、p66、p51和p31在96%以上,p17、p55分別為86.4%和85.6%.上海，36例WB試驗gp120和p24雙陽性者的跟蹤隨訪和核酸輔助診斷發(fā)現(xiàn)，至少24例可判定為HIV-1感染。5例樣本的核酸測定結(jié)果與血清學(xué)隨訪檢測結(jié)果的符合率達(dá)到100%。25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進(jìn)展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)（五）假陰性結(jié)果指EIA+WB的假陰性原因急性感染后的抗體遲反應(yīng)不同HIV毒株型發(fā)病晚期抗體消失窗口期：幾周到6個月，與當(dāng)?shù)豀IV流行率有關(guān)HIV亞型，M/N/O組間差異（六）、確認(rèn)試驗不確定標(biāo)本的常規(guī)處理按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2004年版）》的要求，只能作“3個月后復(fù)檢”的處理，三個月后復(fù)檢1次，連續(xù)2次，共6個月。其轉(zhuǎn)歸有兩種可能：仍呈現(xiàn)不確定或陰性，則診斷為HIV抗體陰性；帶型發(fā)生進(jìn)展，符合HIV抗體陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，則診斷為HIV抗體陽性。后者是真正的窗口期感染者（一般為2-3個月，最長6個月）

，只占很小的比例；大多數(shù)為非感染者，但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶。如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進(jìn)行實驗診斷。大多數(shù)為非感染者，但由于WB反應(yīng)的敏感性而出現(xiàn)條帶。4、P24抗原檢測：陽性結(jié)果需經(jīng)中和實驗確認(rèn)，才提示HIV感染。性，1份假陽性，1份假陰性，因此⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：2．指某試驗檢出陽性的能力（無假陰性）。按照《全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范（2004年版）》的要求，只能作“3個月后復(fù)檢”的處理，三個月后復(fù)檢1次，連續(xù)2次，共6個月。PPV=45/(45+5)×100%=90%HIVantibodiesImagefrom:KahnandWalker,M.HIV的基因組結(jié)構(gòu)和蛋白5．艾滋病病原診斷中的幾個問題預(yù)示值(%)如有必要，可用輔助診斷方法對不確定樣本進(jìn)行實驗診斷?？焖?4-5y:(2%)ELISA篩查陽性結(jié)果中，WB不確定占4-20%,俄羅斯報告占12.蛋白酶反轉(zhuǎn)錄酶整合酶酶聯(lián)試驗敏感性高于確認(rèn)試驗，四代試劑敏感性更高，確認(rèn)陰性的不一定是真陰性。急性感染后的抗體遲反應(yīng)表1ELISA法HIV1抗體測定的預(yù)示值感染HIV后的血清學(xué)變化小于18個月嬰兒在10000拷貝/毫升應(yīng)做HIV感染處理?！鶛z測試劑以ELISA為主，還有PA，斑點(diǎn)免疫膠體金和免疫層析。陰性不排除感染，因敏感性低：30－80％。⑴明確不同實驗方法的意義和適應(yīng)范圍：HIV-1早期感染病毒標(biāo)志物的動態(tài)觀察（四）WB不確定結(jié)果的有關(guān)數(shù)據(jù)緩慢/長期不進(jìn)展:>10y:(2%)HIVantibodies2、低度為S/CO<1,中度為1<S/CO<6,高度為S/CO>6。窗口期：幾周到6個月，與當(dāng)?shù)豀IV流行率有關(guān)25例隨訪到的對象中，18例樣本平均17天后條帶有明顯進(jìn)展，可以判定為HIV抗體陽轉(zhuǎn)。HIVantibodies特異度=————————100%HIV亞型，M/N/O組間差異診斷HIV感染在早期可檢測抗原，而在感染后的大多數(shù)時間，可用血清學(xué)方法診斷。驗出現(xiàn)陽性