熒光蛋白表達課件

熒光蛋白表達課件第一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二0103020405背景介紹實驗流程實驗設(shè)計實驗結(jié)果參考文獻目錄第三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二背景介紹第四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二綠色熒光蛋白GFP第五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二增強型GFP（EGFP）

野生型GFP折疊易受溫度影響，發(fā)光較弱，并且在某些細胞中不表達，因此人們運用定點突變等技術(shù)對野生型GFP進行了改造。目前應(yīng)用較為廣泛的是增強型GFP（EGFP），它是將Ser65用Thr替代，Phe64用Leu替代，使GFP的熒光強度提高了35倍，而且激發(fā)后16~24h后仍可穩(wěn)定地檢測到熒光。第七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二GFP的熒光性質(zhì)及應(yīng)用優(yōu)點(1)易于檢測，靈敏度高。(2)熒光性質(zhì)穩(wěn)定。(3)對細胞無毒害。(4)構(gòu)建載體方便。(5)可直接用于活細胞測定。(6)不受假陽性干擾。(7)廣譜性。(8)易于得到突變體。第八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二EGFP氨基酸序列由Prasher等成功克隆出了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。氨基酸序列：MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。第十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)極大地推動了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用前景廣闊。GFP及其突變體已被廣泛應(yīng)用于基因表達調(diào)控、蛋白質(zhì)空間定位、生物分子之間相互作用、轉(zhuǎn)基因動物等方面?；谛滦凸δ軣晒獾鞍?如光激活熒光蛋白和光轉(zhuǎn)換熒光蛋白和氧化還原敏感的GFP等)的光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展，為在活細胞乃至活體動物內(nèi)研究基因表達和蛋白質(zhì)功能提供了更多的選擇空間。第十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二GFP用途1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動物的篩選標記2、GFP在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用第十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二1、作為轉(zhuǎn)基因植物和動物的篩選標記分子標記：作為一種新型的報告基因，GFP已在生物學(xué)的許多研究領(lǐng)域得到應(yīng)用。利用綠色熒光蛋白獨特的發(fā)光機制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標簽(proteintagging)，即利用DNA重組術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染合適的細胞進行表達，然后借助熒光顯微鏡便可對標記的蛋白質(zhì)進行細胞內(nèi)活體觀察。第十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二GFP的相對分子質(zhì)量小，能與多種不同的蛋白質(zhì)N端或C端融合而保持其天然蛋白質(zhì)的特性，可特異地進行蛋白質(zhì)及細胞器的地位研究。大量實驗表明，GFP可定位到細胞核、細胞骨架、葉綠體、線粒體等細胞器中。另外、將GFP作為活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的標記分子，利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微技術(shù)可以研究細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)之間的相互作用。第十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二2.1在生物學(xué)研究中的應(yīng)用GFP可以作為標記分子，目前已被廣泛應(yīng)用于基因標記、蛋白質(zhì)標記、環(huán)境微生物研究、寄生蟲學(xué)研究以及發(fā)育生物學(xué)研究中基因表達模式的探索等方面，成為活細胞分子水平研究的工具。目前生物農(nóng)藥的殺蟲效果往往得不到準確評估，而利用GFP標記，通過熒光觀察可以避免評估殺蟲劑殺蟲效果時僅僅記錄有典型感染癥狀的害蟲個體，而忽視無明顯感染癥狀但確實已經(jīng)感染或正在感染的害蟲個體，同時無需進行分子生物學(xué)鑒定即可方便地區(qū)分殺蟲劑致死和天然病原致死，從而客觀準確地評價殺蟲劑的毒力。第十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二2.2在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用GFP在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用將GFP基因直接導(dǎo)入目標生物或?qū)FP基因克隆到病毒、細菌或質(zhì)粒上，通過它們的介導(dǎo)而間接標記目標生物，進行生態(tài)學(xué)規(guī)律研究。用GFP基因標記遺傳工程微生物以監(jiān)測其在水環(huán)境中的存活和去向。朱應(yīng)等構(gòu)建了帶GFP基因的重組棉鈴蟲病毒。該病毒一次感染棉鈴蟲后不再重復(fù)感染，室內(nèi)飼養(yǎng)3代，各代均可見典型的發(fā)綠色熒光的棉鈴蟲，表明病毒可以介導(dǎo)GFP標記其宿主，預(yù)計將為研究棉鈴蟲的遷飛和暴發(fā)規(guī)律提供強有力的手段。跟蹤觀察微生物。傳統(tǒng)方法中，一般用熒光染料標記微生物，由于微生物的分裂，燃料被稀釋，因此長期以來未能觀察到微生物侵入活細胞的實時動態(tài)過程。GFP基因能克服上述的缺點，且在活細胞中能直接觀察到無需破壞原有細胞而阻止感染的繼續(xù)進行。第十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二2.3在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用在組織工程的種子細胞研究中，有學(xué)者利用GFP示蹤證實了脂肪來源的干細胞的分化方向和分化能力；利用增強型GFP篩選合適的生物材料，如發(fā)現(xiàn)最合適的構(gòu)建氣管軟骨的細胞來源是肋軟骨細胞。GFP還用于細胞因子作用的研究，如發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子的持續(xù)表達可以延緩成牙骨質(zhì)細胞的鈣化過程；以及活體動態(tài)觀察的研究，為脊柱和椎間盤等部位的細胞治療或基因治療后的隨訪建立了新研究方法。在藥學(xué)研究中，用GFP對目的物進行標記，分析目的物在細胞中的變化情況，如酶分子分布狀態(tài)、生物活性、受體、離子通道等變化，從而從眾多的化合物中篩選出與體內(nèi)信號分子功能相似“潛力”化合物，這樣的方法簡便易行。因此，GFP成為了藥物篩選及藥物作用機制研究中的有力工具。第十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二在眼科中，許多視網(wǎng)膜疾病如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變等由于遺傳缺陷或基因表達異常等導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)異常、代謝紊亂或促進與抑制新生血管形成因子表達，從而嚴重危害視力。GFP也廣泛應(yīng)用于視網(wǎng)膜的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、目的基因的調(diào)控及感光細胞凋亡保護的研究。在免疫學(xué)治療方面，應(yīng)用GFP作為表皮生長因子受體研究的工具，并對第二信使蛋白進行亞細胞定位，這不僅可以揭示其在活細胞內(nèi)作用，還可以觀察一些抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等信號傳導(dǎo)抑制藥物的作用效應(yīng)。第十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白RFP第十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白的來源

1999年,Matz等從印度洋2太平洋地區(qū)的珊瑚蟲中分離出6種與綠色熒光蛋白(greenfluorescentproteins,GFP)同源的熒光蛋白,并鑒定了它們的光譜性質(zhì)。其中來源于Discosomasp.紅色熒光蛋白(drFP583)在紫外線的照射下可發(fā)射紅色熒光,其最大吸收波長為558nm,最大發(fā)射波長為583nm。其發(fā)射波長較長,靈敏度與信噪比均比GFP高,為基于GFP的體內(nèi)研究提供了一個很好的互補工具。第二十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白的演變drFP583具有自身的缺點,如寡聚化、成熟過程緩慢和對細胞有毒性等限制了它的應(yīng)用。因此,人們對其進行各種修飾和改進,以得到不同發(fā)光特性、不同聚集狀態(tài)及適于不同細胞的突變體。最先進行突變實驗的是drFP583,而Clontech公司已將它的一個低毒、低寡聚化及成熟快的突變體E572NA商業(yè)化,商品名為DsRed。第二代DsRed，即大家所熟知的DsRed2，它的多肽氨基末端已經(jīng)進行了一些突變改造，這樣就可以使組織蛋白凝

集和降低毒性。

在第三代DsRed的突變體中，成熟時間

更短，熒光強度也增強。第二十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第二十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白序列第二十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白的應(yīng)用

紅色熒光蛋白極大的豐富了細胞內(nèi)或體內(nèi)光學(xué)成像的熒光探針，使其能夠與生物體內(nèi)多種物質(zhì)聯(lián)合，實現(xiàn)對生物體內(nèi)生命物質(zhì)活動的監(jiān)視，紅色熒光蛋白在繼綠色熒光蛋白后，在某種定義下可以說是革新了生物學(xué)研究——運用紅色熒光蛋白可以檢測到細胞的活動，可以標記表達蛋白，可以進行深入的蛋白質(zhì)組學(xué)實驗等。特別是在癌癥的研究過程中，由于紅色熒光蛋白的出現(xiàn)使得科學(xué)家們能夠觀測到腫瘤細胞的具體活動，比如腫瘤細胞的成長、入侵、轉(zhuǎn)移和新生等，應(yīng)用前景廣泛。第二十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二紅色熒光蛋白的應(yīng)用

在活細胞及動物全身成像中需要表現(xiàn)較好的紅色熒光蛋白，主要是由于在多種顏色成像實驗中需要紅色探針，另外基于較長的激發(fā)波長產(chǎn)生的光毒性較小，可以用來探測較深的生物組織。第二十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二黃色熒光蛋白YFP第二十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二

黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein，YFP）可以看做GFP一種突變體，最初來源于維多利亞多管水母（Aequoreavictoria）。相對于綠色熒光蛋白，其熒光向紅色光譜偏移，而這主要是由于蛋白203位蘇氨酸變?yōu)槔野彼?。其最大激發(fā)波長為514nm，最大發(fā)射波長為527nm。第二十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第二十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二YFP序列1atgaagttcgttgtacgggccctgaccgcgaccgccgtggcggcggcggtcgccgccctc61gccggatgctcggcgacctcgccggcccccggctccgccgagggctcctcagcggggacg121aagctcgtcgtctacacgccgcagggcgaccccgtgcgcgggggctacatcaccaagcac181gccaaatcggacctcggcctggacgtaaagctggtcaacggggcgggcggagatctcgcc241acccgcctcatcgccgagaagaacaacccgcaggcggacgtcgtcgtcgtcctcggggca301ccgcagctcaaccggatcgaccaggcgggtgtgctccagcctttcgctccagactgggcc361ggcaagatcccgtccgccttcgcgtccggaagcaaggacttcacactgctgacgcagacc421ccgatcgcgatcgcctacaacgcgtccacgatgacggcggcccaggcgccgagcagttgg481acggacctggccaagccggagtacaaggacaagttcgccttcccggccctcaccagccag541acgggccaggcggcagccgtgggaatcctgtggcgctacgccgatcacacgaccggcacg601gtgtcgcagaaaggctgggacacgctcgccgcgatcctccacaacgccaagcagaccgcc661gccggcgcgccgttcgactgggcacaggtgaggtccggcgttcagccgatcgtggtgagc721tggctgggcggcattcaaaccggcacctccgacaacaccatcgacctcaggatcgtcgac781gccgtcggcgggagcccgttcgtcaacggcggcgtcggcatggtcaaggacacgaagaac841gcagccgcggcccgcaagttcatcgactggttcggctccgacagcttccaggtcgggttc901gtcaccgcgacgaagaacgatacccccctcaacccggatgcggtcaagcggctccccggg961gccgagcagggactgcgccaggtcaccccgcagaagatcgactggggcgtggtgtcccag1021cgcctctcggactggttgcagaagatccagctcgatgtgcagggctga第二十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二

像綠色熒光蛋白一樣，YFP是細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)中一種非常常用的報告基因。目前，有三種改良的黃色熒光蛋白：Citrine,Venus,andYpet。這三種改良的蛋白熒光更亮，更穩(wěn)定，而且成熟更快，因此應(yīng)用廣泛。黃色熒光蛋白最常用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，作為熒光能量的接受體（acceptor）。第三十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二2.所用質(zhì)粒介紹PUC19質(zhì)粒

大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19,簡稱pUC19，是質(zhì)粒載體的一種。在由限制性核酸內(nèi)切酶修飾過的質(zhì)粒DNA序列中插入外源的目的基因，以質(zhì)粒為載體，將目的基因通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法導(dǎo)進宿主細胞，pUC19常用于DNA片段克隆、DNA測序、外源基因表達等。

pUC19大小只有2686bp，是最常用的質(zhì)粒載體，其結(jié)構(gòu)組成緊湊，幾乎不含多余的DNA片段，GenBank注冊號為L08752(pUC18)和X02514(pUC19)。由pBR322改造而來，其中l(wèi)acZ(MSC)來自M13mp18/19圖3-4是其質(zhì)粒圖譜。pUC系列載體含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現(xiàn)α-互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過α-互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質(zhì)粒。

第三十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第三十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二pET-28a載體

pET-28a-c(+)載體帶有一個N端的His/Thrombin/T7蛋白標簽，同時含有一個可以選擇的C端His標簽。pET28a載體的單一的多克隆位點見上面的環(huán)狀質(zhì)粒圖譜。注意：載體序列是以pBR322質(zhì)粒的編碼規(guī)矩進行編碼的，所以T7蛋白表達區(qū)在質(zhì)粒圖譜上面是反向的。

T7RNA聚合酶啟動的克隆和表達區(qū)域在質(zhì)粒圖譜中也被標注了出來。質(zhì)粒的F1復(fù)制子是被定向的，所以在T7噬菌體聚合酶的作用下，包含有蛋白編碼序列的病毒粒子能夠產(chǎn)生，并啟動蛋白表達，同時蛋白表達將被T7終止子序列(Cat.No.69337-3)的作用下終止蛋白翻譯。第三十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第三十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二兩種菌株差異

克隆宿主：E.coliDH5α缺少目的基因表達相關(guān)的酶，

不能夠表達出目的基因，轉(zhuǎn)入的載體在其中大量復(fù)制；表達宿主：E.coliBL21（DE3）則可以表達出目的基因，即得到綠色、黃色、紅色的熒光蛋白。第三十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二兩種載體差異克隆載體：大多是高拷貝的載體，一般是原核細菌，將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接，再導(dǎo)入原核細菌內(nèi)，質(zhì)粒會在原核細菌內(nèi)大量復(fù)制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定會表達，但一定被大量復(fù)制。表達載體：就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達的載體?？寺≥d體目的在于復(fù)制足夠多的目標質(zhì)粒，所以常帶有較強的自我復(fù)制元件，如復(fù)制起始位點等，往往在菌體內(nèi)存在多拷貝，所以抽質(zhì)粒會抽出一大堆，但不具備表達元件。而表達質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成，為的是控制目標蛋白的表達，如各種啟動子（T7），調(diào)節(jié)子（LacZ）等，而且以pET為代表的表達載體在菌體內(nèi)都是低拷貝的，防止?jié)B漏表達。

是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子--核糖體結(jié)合位點--克隆位點--轉(zhuǎn)錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標志。第三十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)

大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因工程中常用的工具。雖然它不能像真核系統(tǒng)一樣進行翻譯后加工，但由于其遺傳背景相對比較清楚，使用安全、操作簡便、周期短、經(jīng)濟，因此仍然是使用最廣泛的、也是不可被替代的系統(tǒng)。表達系統(tǒng)的核心是表達載體。用來在大腸桿菌中表達外源基因的載體有很多種。構(gòu)建有效的表達載體是表達目的基因的基本要求，同時也是影響基因表達水平以及蛋白活性的總要因素。標準的大腸桿菌表達載體的主要組成包括：啟動子、操縱子、核糖體結(jié)合位點、翻譯起始區(qū)、多克隆位點、終止子、復(fù)制起點以及抗性篩選因子等。第三十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二3.大腸桿菌表達載體及表達系統(tǒng)一般來說,這些載體應(yīng)滿足以下要求:重組質(zhì)?？截悢?shù)高，表達量高適用范圍廣表達產(chǎn)物容易純化在菌體內(nèi)穩(wěn)定性好目前已知的應(yīng)用較廣的大腸桿菌表達載體有非融合表達載體、融合表達載體、分泌型表達載體和表面呈現(xiàn)表達載體等。第三十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二

pET表達系統(tǒng)簡介pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白的最強大系統(tǒng),它是最初由Studier等利用與啟動子配套能高效轉(zhuǎn)錄特定基因的外源RNA聚合酶構(gòu)建的T7RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng),可以從各種基因(包括原核、真核細胞)生產(chǎn)大量的目的蛋白,pET表達系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下幾個方面:

※優(yōu)化靶蛋白表達:pET系統(tǒng)以其獨特的優(yōu)勢和載體、宿主之間重組的“協(xié)調(diào)”而優(yōu)化特異靶蛋白表達。

※嚴格控制基礎(chǔ)表達水平:

pET表達系統(tǒng)能嚴格控制誘導(dǎo)劑缺失時的基礎(chǔ)表達水平,許多難用其他E1coli表達系統(tǒng)表達的基因可在pET系統(tǒng)中高效穩(wěn)定地克隆和表達。

※宿主菌的最佳背景:pET系統(tǒng)有11種不同DE3溶原化宿主菌,其中使用最廣泛的為BL21及其衍生菌株,它的優(yōu)點在于缺失lon和ompT蛋白酶。

第三十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二4.SDS原理及蛋白分離與檢測

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS，polyacrylamidegelelectrophoresis）方法可對蛋白質(zhì)的組分進行分離，并可精確測得蛋白質(zhì)的分子量。常用的方法為SDS不連續(xù)系統(tǒng)。第四十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二

SDS是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和SDS后，分子被解聚成多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈和SDS結(jié)合成蛋白-SDS膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結(jié)構(gòu)差異。第四十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二

SDS首次由Shapiro等提出后,已成為廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分離的一種方法。由于SDS是一種陰離子去污劑,在還原劑(β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇,DTT)存在下,能破壞蛋白質(zhì)亞基之間的非共價鍵,使其解離成單個的亞基,能按照一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物,其負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷,也就消除或降低不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別,這樣就使電泳遷移率只取決于相對分子量大小這一因素。由于SDS儀器簡單、操作方便、重復(fù)性好、可靠性強,除了測定蛋白質(zhì)分子量外,還可以作為一種分離、純化的工具,此方法對于其他方法難溶的復(fù)合酶、病毒、及膜蛋白都可通過其解離作用而進行分析,而且對于某些變性蛋白質(zhì)也能很方便直觀的分離出來。第四十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二實驗設(shè)計第四十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二6.重組蛋白的SDS檢測1.獲得目的基因5.EGFP基因的原核表達及檢測3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliBL21第四十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二詳細實驗流程第四十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二一、實驗試劑上、下游引物,ddH2O,10XBuffer,dNTP,質(zhì)粒pEGFP-N3&pET-28a(+),TaqDNA聚合酶,限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ&EcoRⅠ,T4DNA連接酶,CaCl2溶液,膠回收試劑盒(BindingBuffer,洗脫緩沖液,SPWWashbuffer),質(zhì)粒小提試劑盒(含有RnaseA的溶液I,溶液II,溶液III,HBbuffer,DNAwashingbuffer,elutionbuffer),LB培養(yǎng)基(LP0042TRYRTONE1%,LP0021YEASTEXTRACT0.5%,NaCl1%),麥康凱培養(yǎng)基(蛋白胨17g,脙胨3g,豬膽鹽5g,NaCl5g,瓊脂17g,ddH2O1000mL,乳糖10g,0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL,0.5%中性紅水溶液5mL),卡那霉素,TAE,EB溶液;30%丙烯酰胺(Acr);10%SDS;1.5mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.9);1.0mol/LTris-HCl緩沖液(pH6.8);0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.0);TEMED;樣品溶解液;固定液;染色液;脫色液。第四十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二二、實驗儀器PCR儀、1.5ml離心管、PCR管、移液槍、酒精燈、槍尖、Ep管、培養(yǎng)皿、牙簽、試管、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、離心機、旋渦振蕩器、微波爐、電泳儀、制膠槽、電泳槽、梳子、錐形瓶、電子天平、手套、接種環(huán)、玻璃板、制膠板、模具、電吹風(fēng)、SDS電泳儀第四十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二1.獲得目的基因第四十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二第四十九頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二2.將目的基因插入到載體pET-28a(+)上第五十頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二3.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆宿主E.coliDH5α第五十一頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二4.質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主E.coliBL21第五十二頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二5.EGFP基因的原核表達及檢測第五十三頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二6.重組蛋白的SDS檢測第五十四頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二預(yù)期實驗結(jié)果第五十五頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二pET-28a：5369bp左右EGFP：6.1kb左右ERFP：6kb左右EYFP：6.5kb1.目的基因和pET-28a質(zhì)粒雙酶切電泳結(jié)果：第五十六頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二SDS：樣品在26KD存在條帶，對照1和對照2沒有；自然光下菌落呈綠色可說明pET28a-EGFP能夠在原核系統(tǒng)中得到高效表達,并且表達效果較好。2.熒光蛋白誘導(dǎo)表達與檢測：第五十七頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二參考文獻第五十八頁，共六十頁，編輯于2023年，星期二[1]ShimomuraO,JohnsonFH,SaigaY.Extraction,purificationandpropertiesofaequorin,abioluminescentproteinfromtheluminoushydromedusan,Aequorea[J].J.Cell.Comp.Physiol.,1962,59(3):223239.[2]吳沛橋,巴曉革,胡海,等.綠色熒光蛋白GFP的研究進展及應(yīng)用[J].生物醫(yī)學(xué)工程研究,