藥物定量分析

藥物定量分析第一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)

含金屬或鹵素有機藥物

的前處理方法

第二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二一．有機藥物中金屬或鹵素的結合狀態(tài)二．不經有機破壞的分析方法三．經有機破壞的分析方法第三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1．含金屬的有機藥物金屬原子不直接與碳原子相連

----結合不牢固有機酸及酚的金屬鹽或配位化合物。金屬原子直接與碳原子以共價鍵相連

----結合牢固

有機金屬藥物一．有機藥物中金屬或鹵素的結合狀態(tài)第四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．含鹵素的有機藥物鹵素和芳環(huán)相連：

結合牢固鹵素和脂肪鏈的碳原子相連：

結合不牢固第五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二（一）直接測定法適用于：水溶液中可以電離的藥物二．不經有機破壞的分析方法金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬藥物某些C-M鍵結合不牢固的有機金屬藥物如富馬酸亞鐵的含測第六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二直接回流后測定法：適用于鹵素原子結合不牢固的含鹵素有機藥物

三氯叔丁醇的含測/六氯對二甲苯硫酸水解后測定法：

適用于金屬原子不直接與碳原子相連的含金屬的有機藥物。

硬脂酸鎂的含測（二）經水解后測定法第七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1．堿性還原后測定適用于鹵素原子和芳環(huán)結合的含鹵素有機藥物。生成的無機鹵化物用銀量法測定.2．酸性還原后測定同上3．利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測定含量含Sb5+藥物，含Fe3+藥物（三）經氧化還原后測定法第八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

適用于結合狀態(tài)牢固的有機金屬藥物和含鹵素有機藥物（一）濕法破壞利用強氧化劑將有機金屬轉變成金屬離子。1．硝酸-高氯酸法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞。破壞后的金屬離子以高價態(tài)存在。對含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全。三．經有機破壞的分析方法第九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．硝酸-硫酸法適用于大多數有機藥物的破壞，但不適用于含堿土金屬有機藥物的破壞。（生成硫酸鹽沉淀）破壞后的金屬離子以高價態(tài)存在。３．硫酸-硫酸鹽法常用于含砷或銻有機藥物的破壞，得到低價態(tài)的三價砷或銻離子。第十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二（二）干法破壞

----將有機物灼燒灰化適用于濕法不易破壞完全的有機藥物及某些不能用硫酸破壞的有機藥物不適用于含易揮發(fā)金屬有機藥物的破壞（砷、汞）常加入無水碳酸鈉或輕質氧化鎂助灰化第十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

-----是一種能將有機化合物中的待測元素定量分解成離子的快速有機破壞方法應注意的有關問題：氧氣要充足，確保燃燒完全燃燒產生的煙霧應被完全定量吸收（三）氧瓶燃燒法

oxygenflaskcombustionmethod第十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二樣品點燃放入燃燒瓶后，應用手按緊瓶塞（最好用少量水封閉瓶口），直到火焰熄滅，以防燃燒產生的熱氣將瓶塞頂動；測定氟化物，應用石英燃燒瓶。生成的HF腐蝕玻璃，且與玻璃中的硼生成BF3(BF3在水溶液中僅部分解離成氟離子，使氟的測定結果偏低)；燃燒瓶洗凈；防爆。第十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)

定量分析方法特點第十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二一．容量分析法二．光譜分析法三．色譜分析法第十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二一．容量分析法1．方法：2．關鍵：

準確地確定等當點3．滴定誤差：滴定終點與等當點之間的誤差

將已知濃度的滴定液由滴定管加到待測藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測藥物按化學計量反應完全為止，然后根據滴定液的濃度和消耗的體積，就可以計算出被測藥物的含量滴定液與被測藥物完全作用，反應達到化學計量點即等當點第十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二4．特點：簡便，快速，精密、準確專屬性、靈敏度較差

常用于測定高含量或中含量組分

1%以上的含量第十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二5．計算問題滴定度T：指每ml某摩爾濃度的滴定液所相當的被測藥物的重量

aA+bB?cC+dDT=M×(b/a)×B（mg/ml）

M:滴定液的毫摩爾濃度(mmol/ml)；

B:被測藥物的毫摩爾質量(mg/mmol)第十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二百分含量計算：直接滴定：含量%=F=滴定液的實際摩爾濃度/滴定液的規(guī)定摩爾濃度第二十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二剩余滴定（做空白實驗）：先加入定量過量的滴定液A,當與被測藥物反應完全后,再用另一滴定液B回滴剩余的滴定液A

含量%=

V0：空白試驗消耗滴定液B的體積

VB：樣品測定試驗消耗滴定液B的體積第二十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二二．光譜分析法1．Lambert-Beer定律ε：摩爾吸收系數：百分吸收系數

ε=×(M/10)（一）UV-Vis分光光度法第二十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．儀器校正和檢定波長校正：儀器使用前校正吸收度準確度的檢定：用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定雜散光的檢查：第二十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二3.對溶劑的要求溶劑在所選波長附近的吸收度應不超過一定值空氣為空白第二十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二4．測定法核對:

供試品的實際吸收峰波長是否與藥典給出的波長一致(±1nm)

如果不一致，可能與試樣的真?zhèn)巍⒓兌燃皟x器波長的準確度有關.第二十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二選擇合適的定量方法測定校正曲線法對照法吸收系數法:

儀器應仔細校對、檢定計算分光光度法以配制供試品溶液的同批溶劑為空白第二十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1．特點應在低濃度溶液中進行

高濃度：產生內濾光效應和自吸收現象線性偏離內濾光效應：溶液中存在能吸收激發(fā)光和熒光的物質，使熒光強度減少。干擾多，需做空白試驗（二）熒光分析法第二十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二校正儀器靈敏度：供試品對激發(fā)光穩(wěn)定：可用樣品的對照品溶液校正供試品對激發(fā)光不穩(wěn)定：

采用發(fā)射光譜與供試品近似的物質校正藍色熒光---硫酸奎寧的稀硫酸溶液黃綠色熒光---熒光素鈉水溶液紅色熒光---羅丹明B水溶液第二十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．含量測定

Cx=×Cs

0.5-2.0

熒光強度與藥物濃度成正比關系第二十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1．HPLC法最常用固定相：

octadecylsilane-bondedsilicagel

十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18）柱溫、檢測器：

室溫、紫外檢測器三.色譜分析法第三十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二藥典正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分和檢測器類型不得任意改變外，其余條件如色譜柱內經、長度、固定相牌號、流動相流速及各組分比例等可適當改變，以適應具體樣品品種及達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。第三十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

系統(tǒng)適用性試驗色譜柱的理論塔板數分離度重復性拖尾因子第三十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二色譜柱的理論塔板數N=5.54(tR/W1/2)2=16(t/W)2

改變柱長、內徑、固定相牌號、固定相顆粒粒徑等

第三十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二定量峰與其它峰或內標峰之間的分離度R應大于1.5分離度第三十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣5次，其峰面積測量值的RSD不應大于2.0%配制相當于80%，100%，120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內標溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進樣3次，計算平均校正因子，其RSD不應大于2.0%重復性第三十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

T=W0.05h/2AW0.05h：0.05峰高處的峰寬

A：峰前沿與色譜峰頂點至基線的垂線之間的距離峰高法定量：T應在0.95-1.05之間拖尾因子第三十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二藥物分析中常用的HPLC定量方法：內標法：

內標校正曲線法內標一點法：對照法內標校正因子法外標法：

標準曲線法外標一點法：對照法第三十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．氣相色譜法藥典正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定液品種、檢測器類型及特殊指定的色譜柱材料不得任意改變外，其余條件如色譜柱內經、長度、載體牌號、載氣流速等可適當改變，以適應具體品種及系統(tǒng)適用性試驗的要求。第三十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二系統(tǒng)適用性試驗：同HPLC定量方法：手動進樣：內標法消除較大的進樣誤差留針時間、氣化室高溫自動進樣：內標法、外標法頂空進樣：標準溶液加入法(內加法)

消除基質效應的影響供試品和對照品處于不完全相同的基質中第三十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二標準溶液加入法精密稱取待測成分對照品適量，配制成適當濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據外標法或內標法測定主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中主成分含量。第四十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二外標法按下述公式進行計算：加入對照品溶液前、后校正因子應相同，即：Cx和Ax：供試品中組分X的濃度和色譜峰面積；△Cx：所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度；Ais：加入對照品后組分X的色譜峰面積。第四十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)

藥品質量標準分析方法

驗證第四十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

需驗證的分析項目：鑒別試驗雜質限度或定量檢查原料藥或制劑中有效成分的含量測定制劑中其它成分的含量測定溶出度、釋放度測定方法第四十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

需驗證的內容：準確度精密度專屬性檢測限定量限線性線性范圍耐用性第四十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二一．準確度高、中、低三個濃度，每個濃度3份1．原料藥：

用已知純度的對照品測定。第四十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．制劑：用含已知量被測物（對照品）的各組分混合物進行測定－－回收率若不能得到制劑的全部組分，可向已測定含量的制劑中加入已知量待測物（對照品）進行測定。

－－加樣回收率第四十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1．表示方法

標準偏差SD

相對標準偏差

relativestandarddeviationRSD

即變異系數

coefficientofvariationCV二．精密度第四十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2.重復性在相同條件下，由同一個分析人員測定同一種樣品所得結果的精密度。

日內精密度測定高、中、低3個不同濃度的樣品，每個濃度測定3-5份樣本?；蛞环N濃度的溶液連續(xù)測定6次。第四十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二3．中間精密度在同一個實驗室、不同時間由不同分析人員用不同儀器測定結果的精密度。常做日間精密度

由于測定持續(xù)時間長，往往在同一天內不能完成，故樣品測定時使用的儀器性能、試劑、標準曲線及環(huán)境條件等都可能發(fā)生變化，而使測定結果發(fā)生變化。第四十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二４．重現性在不同實驗室，由不同分析人員測定結果的精密度。若分析方法作為法定標準，應做第五十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二指樣品中有其他成分存在時，分析方法能準確測定出待測藥物的特性鑒別、雜質檢查和含量測定：均考察專屬性對鑒別反應：不含被測藥物的樣品，應呈負反應三．專屬性第五十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二對雜質檢查和含量測定：待測成分應能與其它成分分離給出代表性圖譜，說明專屬性若無雜質和降解產物，可用強光照射、高溫、高濕、酸破壞、堿破壞、氧化破壞的方法，產生雜質和降解產物．第五十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二指待測物能被檢測出的最低濃度或量。反映：分析方法與儀器的靈敏度、儀器的噪音大小、

樣品經處理后空白值的高低。

四．檢測限

limitofdetection,LOD第五十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二１．UV-Vis和熒光分光光度法做多次空白試驗，求背景響應值的標準偏差SD，則:LOD=3SD有時用校正系數進行校正：UV-Vis：

LOD=f×3SD=（C樣

/A樣）×3SD熒光分析：

LOD=f×3SD=[C樣

/（F樣-F空）]×3SD第五十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．色譜法

S/N=2或3時的對應濃度或注入儀器的量第五十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二指待測物能被定量測定的最低濃度或量。能滿足一定準確度和精密度的要求S/N=10時，待測物濃度或注入儀器的量五．定量限limitofquantitation,LOQ第五十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二在一定濃度范圍內，測試結果與樣品中待測物濃度或量直接呈正比關系的程度。UV法：C~A色譜法：C~HorA數據要求：回歸方程、相關系數和線性圖。至少5個點六．線性第五十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二達到一定精密度、準確度和線性，測試方法適用的高、低限濃度或量的區(qū)間。通常指線性范圍七．范圍第五十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

當測定條件有小的變動時，測定結果不受影響的承受程度。常見變動因素：被測溶液的穩(wěn)定性；樣品提取次數、時間等；HPLC中：流動相組成和pH，色譜柱的廠牌、批號，柱溫，流動相流速等；GC中：色譜柱的廠牌、批號，固定相和載體的類型，柱溫等。八．耐用性第五十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

驗證分析方法的具體內容

鑒別雜質檢查含量測定及溶出度測定定量限度準確度－＋－＋重復性精密度中間精密度－－＋＋*－－＋＋*專屬性＋＋＋＋檢測限－－**＋－定量限－＋－－線性－＋－＋范圍－＋－＋耐用性＋＋＋＋*已有重現性驗證，則不需**視具體情況予以驗證第六十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)

生物樣品分析概述

第六十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二一．常用樣品的種類、采集和貯藏二．生物樣品分析預處理技術三．定量分析方法驗證第六十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二常用品種：血液、尿液、唾液其次：可用乳汁、淚液、腦脊液、膽汁等。（一）生物樣品一．常用樣品的種類、采集和貯藏第六十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二

1．血樣

血細胞血漿（plasma）血小板血清（serum）血細胞測定血樣中平均分布于細胞內和細胞外的藥濃抗凝自然全血（加抗凝劑）血液第六十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二采樣與保存采樣：保存：血樣（血漿、血清）及時分離→冷藏或-70℃，有時加入穩(wěn)定劑

穩(wěn)定劑：酶抑制劑（NaF、三氯醋酸），抗氧劑解凍方法：

第六十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二2．尿樣目的：藥物劑量回收，藥物清除率，藥物代謝和生物利用度特點：濃度高，易于收集，體內代謝研究，應作水解處理保存：立即測定（尿中含水、無機鹽、尿素等）；4℃保存；放置較長時間需冷凍；加入防腐劑（1%甲苯；飽和氯仿）或改變pH第六十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二1、預處理的目的存在形式的多樣性：游離、結合物、代謝物濃度低，雜質多出現渾濁和沉淀影響色譜柱壽命二．生物樣品分析預處理技術第六十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二藥物理化性質：

pKa親脂性揮發(fā)性溶解度穩(wěn)定性光譜特征與蛋白的結合程度濃度范圍：

測定目的：定性定量母體代謝生物樣品的種類：樣品處理與分析方法的選擇

①專一性②靈敏性2、預處理方法選擇的一般原則第六十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二3、生物樣品中蛋白質的處理（1）目的：去除蛋白質，使結合型藥物和代謝物釋放出來，便于測定總濃度；預防提取過程中蛋白質發(fā)泡，減少乳化的形成；保護儀器性能。第六十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二（2）方法：蛋白質沉淀劑法與水相混溶的有機溶劑：乙腈，甲醇，乙醇，丙酮，THF中性鹽：飽和硫酸銨，硫酸鈉，磷酸鹽，

NaCL，

枸櫞酸鹽強酸：三氯醋酸，高氯酸，硫酸-鎢酸混合液含鋅鹽和酮鹽的沉淀劑：

CuSO4-Na2WO4,ZnSO4-NaOH第七十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二酶解法適用于遇酸不穩(wěn)定及與蛋白質結合牢固的藥物常用蛋白水解酶中的枯草菌溶素（細菌性堿性蛋白分解酶）微孔濾膜法用于測定樣品中的游離藥物或代謝物與蛋白質結合的藥物不能濾過。第七十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二4、生物樣品中綴合物的水解（1）目的：使綴合物中的藥物或代謝物游離，便于用有機溶劑提取綴合物的極性較大第七十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二（2）方法酸水解法：鹽酸酶解法：

β-葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶，二者的混合酶；

溶劑解某些藥物的硫酸酯，往往加入提取溶劑時發(fā)生分解，同時提取到有機溶劑中第七十三頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二5、生物樣品中藥物或代謝物的萃取液-液提取提取率在有機相與水相中溶解度的比值；一般少量多次，提取率高對生物樣品：樣品量少、樣品數多、藥物含量低，一般一次萃取（至多兩次），提取率一般應>50%

第七十四頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二影響提取率的因素水相pH：堿性藥物在堿性pH，酸性藥物在酸性pH提取溶劑：相似相溶原理。沸點低，不影響檢測，性質穩(wěn)定，不起化學反應離子強度：加入中性鹽，增加離子強度，與水結合強，便于有機溶劑提取提取次數：提取-反提取第七十五頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二離子對提取適用于離子性特強，水溶性極大的藥物藥物含陰離子：-COO--SO3-

離子對試劑：烷基季銨鹽藥物含陽離子：-NH+

離子對試劑：烷基或芳基磺酸鹽

第七十六頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二乳化問題預防措施：

①輕緩振搖；

②不溶物應過濾掉

③避免在高pH條件下，從水中提取藥物

④避免使用易發(fā)生乳化的溶劑對：如水-苯，水-己烷

⑤萃取前水相中加入少量NaCl

第七十七頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二乳化問題破乳方法：

①機械法

②加乙醇或少量高級脂肪醇,改變表面張力

③改善混合溶劑比例，增加分散相的百分數第七十八頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二液-固提取操作步驟：①固相柱選擇：依據樣品體積、被測物的量及理化性質②固相柱處理反相C18：固定相的6-10倍體積甲醇洗柱，使溶劑化；6-10倍緩沖液沖洗達分離狀態(tài)③上樣④分離：用適當的弱溶劑洗滌洗去雜質，通N2干燥固相柱⑤洗脫待測物：改變洗脫劑pH或極性第七十九頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二影響液-固提取的因素流速

上樣流速快：按觸不充分，樣品流失,回收率低裝樣：過載樣品突破性試驗：一系列體積的已知濃度樣品液上樣，洗脫后，求回收百分率；當回收率下降時為過載。第八十頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二柱切換HPLC：兩個泵，預柱，分析柱固相微萃取SPME：第八十一頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二第八十二頁，共九十二頁，編輯于2023年，星期二6、生物樣品中待測組分的濃集

避免直接加熱濃縮