蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析第一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二一、蛋白質(zhì)的提取1.材料的選擇2.組織細(xì)胞的粉碎3.蛋白質(zhì)的提取第二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。對(duì)于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對(duì)數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量1.材料的選擇第三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二2.組織細(xì)胞的粉碎1.高速組織搗碎：2.玻璃勻漿器勻漿：3.超聲波處理法：此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過程會(huì)產(chǎn)生大量的熱，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。4.反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。5.化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細(xì)胞，例如腫瘤細(xì)胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細(xì)胞膜破壞，細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。第四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二超聲波細(xì)胞破碎儀第六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二3.蛋白質(zhì)的分離純化一、蛋白質(zhì)（包括酶）的提取大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。第七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。第八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二1.pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化.一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2.鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15mol/L濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。第九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（二）有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。須在低溫下操作丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越：1.因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；2.丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。3.丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。第十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二二、蛋白質(zhì)的分離純化（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離第十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1.蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。第十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法使用丙酮沉淀時(shí)，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。第十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二影響鹽析的因素：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶解度低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。第十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二2.等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。3.低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。4.低溫沉淀第十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1.密度梯度離心用超離心機(jī)對(duì)小分子物質(zhì)溶液，長時(shí)間加一個(gè)離心力場達(dá)到沉降平衡，在沉降池內(nèi)從液面到底部出現(xiàn)一定的密度梯度。若在該溶液里加入少量大分子溶液，則溶液內(nèi)比溶劑密度大的部分就產(chǎn)生大分子沉降，比溶劑密度小的部分就會(huì)上浮，最后在離心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子帶狀物。利用這種現(xiàn)象，測定核酸或蛋白質(zhì)等的浮游密度，或根據(jù)其差別進(jìn)行分析的一種沉降平衡法。原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。第十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二2.透析與超濾應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。透析(dialysis)超濾法利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。第十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二3.應(yīng)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進(jìn)行層析分離待分離蛋白質(zhì)溶液（流動(dòng)相）經(jīng)過一個(gè)固態(tài)物質(zhì)（固定相）時(shí)，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理第十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。凝膠過濾(gelfiltration)又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。蛋白質(zhì)分離常用的層析方法第二十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第二十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開。1.電泳法各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動(dòng)。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)而達(dá)到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)

。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。

第二十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。免疫電泳，把電泳和抗原與抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，常用于蛋白質(zhì)的鑒定和純度的檢查。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:第二十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第二十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度，當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。第二十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第二十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二2.離子交換層析法離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素），當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。第二十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二第二十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（四）根據(jù)配體特異性的分離方法－親和色譜法親和層析法（aflinitychromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。第二十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二三.蛋白質(zhì)的鑒定與含量分析（一）化學(xué)分析法1.純度鑒定2.分子量測定3.等電點(diǎn)測定4.氨基酸分析5.序列分析第三十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二應(yīng)用化學(xué)或反向遺傳學(xué)方法可分析多肽鏈的氨基酸序列分析已純化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基組成測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基把肽鏈水解成片段，分別進(jìn)行分析測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用Edman降解法一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經(jīng)過組合排列對(duì)比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結(jié)果。第三十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二通過核酸來推演蛋白質(zhì)中的氨基酸序列按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列分離編碼蛋白質(zhì)的基因測定DNA序列排列出mRNA序列第三十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二同源模建：將待研究的序列與已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白質(zhì)序列對(duì)齊——補(bǔ)償氨基酸替補(bǔ)、插入和缺失——通過模建和能量優(yōu)化計(jì)算，產(chǎn)生目標(biāo)序列三維結(jié)構(gòu)。序列相似性越高，預(yù)測的模型也越準(zhǔn)確。折疊識(shí)別：通過預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)、預(yù)測折疊方式和參考其它蛋白的空間結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生目標(biāo)序列的三維結(jié)構(gòu)。從無到有：根據(jù)單個(gè)氨基酸形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的傾向，加上各種作用力力場信息，直接產(chǎn)生目標(biāo)序列三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列預(yù)測其三維空間結(jié)構(gòu)：第三十三頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（二）物理分析法：質(zhì)譜法：測定多肽與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸序列X射線晶體衍射和核磁共振圓二色光譜第三十四頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二三級(jí)結(jié)構(gòu)測定X射線衍射法(X-raydiffraction)和核磁共振技術(shù)(nuclearmagneticresonance,NMR)是研究蛋白質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法。第三十五頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二二級(jí)結(jié)構(gòu)測定通常采用圓二色光譜(circulardichroism，CD)測定溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。-螺旋的CD峰有222nm處的負(fù)峰、208nm處的負(fù)峰和198nm處的正峰三個(gè)成分；而-折疊的CD譜不很固定。第三十六頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（三）蛋白質(zhì)含量測定1.凱氏定氮法(Kjedahl法)2.福林-酚試劑法(Lowry法)3.雙縮脲法4.紫外分光光度法5.BCA比色法6.Bradford蛋白分析法第三十七頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二1.凱氏定氮法(Kjedahl法)凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機(jī)氮都轉(zhuǎn)變成無機(jī)銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，就可計(jì)算出樣品中的氮量。由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計(jì)算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。第三十八頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二2.福林-酚試劑法(Lowry法)此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色。在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比。優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長，要精確控制操作時(shí)間第三十九頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二4.紫外分光光度法紫外--可見分光光度法：是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長為200-760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來的一種定性、定量和結(jié)構(gòu)分析方法。操作簡單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。波長長（頻率?。┑墓饩€能量小，波長短（頻率大）的光線能量大。分光光度測量是關(guān)于物質(zhì)分子對(duì)不同波長和特定波長處的輻射吸收程度的測量。第四十頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二5.BCA比色法Bicinchoninicacid(BCA)法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowery法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562nM處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。與Lowery法相比，BCA蛋白測定方法靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小。與Bradford法相比，BCA法的顯著優(yōu)點(diǎn)是不受去垢劑的影響。第四十一頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二6.Bradford蛋白分析法1976年Bradford建立了用考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、敏感的定量測定蛋白質(zhì)的方法。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大光吸收的改變，從465nm變?yōu)?95nm，光吸收增加。蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測定的靈敏度，最低檢出量為1μg蛋白。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過程，大約需2min，結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽離子，如K+，Na+，Mg2+，(NH4)2SO4，乙醇等物質(zhì)不干擾測定，而大量的去污劑如TritonX100，SDS等嚴(yán)重干擾測定，少量的去污劑可通過用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測定。第四十二頁，共五十一頁，編輯于2023年，星期二（四）生物活性分析法(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)即將已知