蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析技術(shù)第一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析生物質(zhì)譜X-射線晶體衍射技術(shù)核磁共振溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的研究方法蛋白質(zhì)組第二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)蛋白質(zhì)和多肽的

氨基酸序列分析Synopsis:

1.Apracticalapproachtodeterminingaminoacidsequencerequiresamethodtoremoveoneaminoacidatatimefromapolypeptidechain.2.Thisisachievedbytheuseofphenylisothiocyanate（異硫氰酸苯酯）astheN-terminallabellingreagent,theEdmanmethod.3.Thistechniquecanonlydealwithchainsof20to60aminoacids,andmostproteinsaremuchlarger.4.Tocompletetheprocess,selectivehydrolysisofthepolypeptidechaincutsverylongpolypeptidesintospecificfragmentsofmoremanageablesize.第三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二N端序列分析Sangerwasthefirstpersontodetermineaproteinsequence,forinsulinin1953.Theproblem:afterlabellingtheN-terminalaminoacid,thepolypeptidechainmustbehydrolysedtoisolateandidentifythelabelledaminoacid.What'sneededisawaytoremovethefirstaminoacidwithouthavingtohydrolyzethewholechain.ThiswassolvedbyPerEdman,inSwedenin1956,byusingthereagentphenylisothiocyanatetolabeltheN-terminalendofthepolypeptidesample.第四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二ItworksbycleavingtheN-terminalAAoffandleavingtherestofthepeptideintact.TheEdmanmethodcanberepeatedonthepeptideremainingafterthereaction,sothisisaveryeffectivemethodforobtainingAAsequenceinformation.InfactthewholesequenceofapeptidecontainingmanyAAscanbedeterminedbyEdmanmethod.第五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二降解反應(yīng)分三步偶聯(lián)

PITC的異硫氰酸酯基與蛋白的自由－氨基作用，產(chǎn)生苯氨基硫甲酰蛋白質(zhì)。裂解

PTC－蛋白質(zhì)在無水條件下酸裂解，切下反應(yīng)的那個殘基，暴露出下一個自由－氨基。轉(zhuǎn)化

ATZ－氨基酸不穩(wěn)定，在三氟乙酸水溶液條件下，轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH－氨基酸。PTH－氨基酸的鑒定薄層層析，HPLC,GC(氣相色譜），質(zhì)譜分析等。第六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)N端測序儀器分析法：1.液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀

最早，很少用2.固相序列分析儀

有些氨基酸不能正確測定3.氣相順序儀

靈敏度很高，降低費用4.新型蛋白測序儀

快速可靠，高自動化第九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二二.C端序列分析適用

1.鑒定重組蛋白是否正確表達2.大規(guī)模生產(chǎn)時質(zhì)量控制3.N端封閉蛋白的分析4.DNA探針的設(shè)計原理化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的C末端衍生物被切割下來，通過HPLC系統(tǒng)進行分析。第十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二步驟活化酰胺化保護側(cè)鏈羧基烷基化修飾Thr和Ser的羥基裂解和衍生第十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二Protein-COOHProtein-TH1timeAlkylationCleavageCyclizationProtein-ATHReleasedATH-AA第十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)生物質(zhì)譜技術(shù)MassSpectrometry

(MS)是帶電原子，分子或分子碎片按質(zhì)荷比(m/z)的大小順序排列的圖譜。軟電離技術(shù)：

離子化過程中不會破壞分子結(jié)構(gòu)電噴霧電離（ESI)(Fennetal.1989)

基質(zhì)輔助激光解析電離（MALDI)(KarasandHillenkamp,1998)質(zhì)譜儀組成：離子源，質(zhì)量分析器，檢測器第十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二MALDI–MS

電離基本原理：將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。激光照射晶體時，使基質(zhì)晶體升華，基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。TheMALDIinstrumentisamatrixassistedlaserdesorptionionisation-time-of-flight（TOF)massspectrometer，specificallyforhighthroughputmassmappingofpeptidedigestfragmentsoriginatingfromproteinsexcisedfrom2D-teomics.

第十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二MALDI離子源

電離技術(shù)的關(guān)鍵----基質(zhì)的使用基質(zhì)的作用：樣品離子形成過程中充當(dāng)質(zhì)子化或去質(zhì)子化試劑，使樣品分子帶上正電荷或負電荷。常用基質(zhì)：

SA(芥子酸）

DHB(龍膽酸）

CCA(a-氰基-4-羥基肉桂酸）第十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二2.質(zhì)量檢測器

1）線性分析時間檢測器（TOF)

優(yōu)點：質(zhì)量分析范圍100Da~100kDa

不足：分辨率和測量準確度低

2）反射分析時間檢測器（RETOF)

分析質(zhì)量數(shù)10kDa以下的離子3.樣品制備

第十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二二.

ESI–MS電離方法：靠強的電場使分子電離。分析物溶液流經(jīng)一個細細的進樣針，針頭上加高電壓用來產(chǎn)生正離子。高電壓導(dǎo)致樣品液流分散為呈噴霧狀的帶電荷的微小滴。當(dāng)液滴從針尖通往入口時，在定向惰性氣體流作用下，溶劑蒸發(fā)，液滴縮小，電荷密度增加，最終液滴爆裂，離子從液相中釋放出來進入氣相。ESI–MS優(yōu)勢：可與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如LC–MS,HPLC–MS等。第十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二Itisoperatedwithelectrosprayionisationandsamplescanbeintroducedintothemassspectrometerbyanumberofdifferenttechniques.第十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二The

Q-Tof

isatandemmassspectrometer(MS/MS)withtwoanalysers。Thefirstbeingaquadrupoleanalyserthesecondanalyserisareflectrontime-of-flightanalyser

InMS/MSmode,thetwoanalysersareusedtogetherforstructuralstudiesbymonitoringfragmentationpatternsinmolecules.

第二十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二The

TSQ7000isatandemquadrupolemassspectrometerequippedwithelecgtrosprayandnanosprayionisation.TheTSQ7000hasarangeofMS/MScapabilities:precursorionscanning,productionscanningandconstantneutrallossscanning,whichmaketheinstrumentidealforthestructuralcharacterisationofawiderangeofbio-andorganicmolecules,andisparticularlyusefulforidentifyingpost-translationalmodifications.第二十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二分子量測定肽譜測定多肽和蛋白質(zhì)序列測定巰基和二硫鍵定位蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)復(fù)合體分析蛋白質(zhì)組研究應(yīng)用第二十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二Horseheartmyoglobincanbeanalysedeitherwiththehaemmoleculeattachedtotheproteinbynon-covalentinteractionsusingneutralaqueousconditions,orinthedenaturedstate(withoutthehaemmolecule)usingacidifiedorganicsolvents.Underneutralconditions(uppertrace)theproteinremainsfoldedandsohasonly8or9siteswhichareexposedforionisation;alsothehaemligandremainsboundandthemassmeasuredis17,564.9Da.Underdenaturingconditions(lowertrace)theproteinismuchmorehighlycharged(n=9to28)duetothehighernumberofsitesexposedintheunfoldedstate,andasthehaemligandisnolongerboundthemassmeasuredis16,951.6Da.第二十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二MonitoringthemodificationofaClassIaldolase(MW37979.3Da)(lowertrace)wasachievedbyESI-MS.Themodificationinvolvedthecovalentadditionofdihydroxyacetonephosphate,thusincreasingthemolecularweightto38,134.3Da(uppertrace).第二十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第二十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)X射線晶體衍射技術(shù)X–raydiffractionmethod

使用X射線作為物理工具，間接地研究蛋白質(zhì)晶體的空間結(jié)構(gòu)。X–raydiffractiontechniquesgiveinformationaboutthestructureofsolids,thatis,thearrangementoftheatomsthatcomposethesolid.第二十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二X射線晶體衍射的基本原理第二十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

利用X射線晶體衍射法測定蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象，結(jié)果比較可靠。但是，與溶液中的構(gòu)象相比，蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象是靜態(tài)的。所以，利用蛋白質(zhì)晶體不能測定不穩(wěn)定的過渡態(tài)的構(gòu)象。而且，很多蛋白質(zhì)很難結(jié)晶，或者很難得到用于結(jié)構(gòu)分析的足夠大的單晶。另外，X射線晶體衍射的工作流程較長。第二十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二蛋白質(zhì)X射線晶體結(jié)構(gòu)測定的基本過程：經(jīng)基因克隆，表達后生成的蛋白質(zhì)提純；晶體生長并經(jīng)冷凍處理；重原子衍生物制備；衍射數(shù)據(jù)收集；衍射數(shù)據(jù)分析和改進；獲得最后的結(jié)構(gòu)模型（包括修正）。第二十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二ProcedureGrowCrystalCollectdiffractionpatterns--intensitiesonlyNativeHeavyatomderivativesCalculatephasesCalculateelectrondensitymapFitatomsintoeletrondensitymapRefinestructure--modifyatomicmodeluntilitfitsdiffractionpatterns第三十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

1.對原材料的要求

應(yīng)具有高度均一性

2.晶體生長的生化，物理條件

pH值，離子強度，溫度等

3.技術(shù)和方法

分批靜置法(batchmethod)

懸滴法(hangingdrop)4.蛋白質(zhì)晶體的鑒定一.蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長Crystallization第三十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.晶體的收集和處理2.X射線源的選擇

陽極靶式同步加速器輻射3.衍射線記錄裝置

照相底片或圖像板（對X射線敏感）計數(shù)管或面探測器4.衍射數(shù)據(jù)收集的全自動化二.衍射數(shù)據(jù)收集

Datacollection第三十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.數(shù)據(jù)的統(tǒng)一和還原2.同晶置換法

single/multipleisomorphousreplacement(SIR/MIR)3.分子置換法

Molecularreplacement(MR)4.多波長反常散射法Anomalousscatteringandmultiplewavelengthanomalousdispersion（MAD）5.差值電子密度法三.確定位相Phasing－核心問題第三十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.電子密度修飾2.分辨率3.分析電子密度圖4.全自動化程序發(fā)展

四.電子密度圖詮釋Mapinterpretation第三十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二1.R因子2.限制性最小二乘修正3.全自動化軟件4.結(jié)構(gòu)模型表達五.結(jié)構(gòu)模型精化Refinement第三十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二Resolution--Higherresolutionallowsmoreaccuratepositioningofatoms第三十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第四節(jié)核磁共振波譜技術(shù)Nuclearmagneticresonance(NMR)

核磁共振是研究處在靜磁場中的原子核與電磁波相互作用的學(xué)科。

NMR技術(shù)是目前唯一能夠用以測定蛋白質(zhì)溶液三維結(jié)構(gòu)的方法。第三十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二NMR測定蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基本過程

第三十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二

核磁共振是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用下，核自旋能級發(fā)生塞曼分裂(Zeemansplitting)，共振吸收某一特定頻率的射頻（radiofrequency,RF）輻射的物理過程。近年來，NMR法測定小蛋白的三維結(jié)構(gòu)得到了成功的應(yīng)用。NMR法不需要制備蛋白質(zhì)晶體，但這種方法僅限于分析長度不超過150個氨基酸殘基的小蛋白。第三十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二應(yīng)用方面：2D和3D－NMR方法已提供相當(dāng)數(shù)量的小蛋白質(zhì)，寡核苷酸，寡糖的三維結(jié)構(gòu)。提供有關(guān)局部結(jié)構(gòu)，構(gòu)象動力學(xué)的信息。用來表征電荷狀態(tài)，構(gòu)象，與配體結(jié)合的解離速度，研究蛋白質(zhì)卷曲與折疊。鑒定蛋白質(zhì)分子中某些原子與配體分子中某些原子的相互接觸，研究大分子之間以及它們與小分子之間相互作用和分子識別。第四十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二由NMR數(shù)據(jù)決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程：

研究樣品的選擇與制備；

NMR數(shù)據(jù)的采集與數(shù)據(jù)處理；質(zhì)子自旋系統(tǒng)的識別與信號歸屬；決定結(jié)構(gòu)約束因子和分析規(guī)則二級結(jié)構(gòu)；計算出符合約束因子的三維結(jié)構(gòu)和進行結(jié)構(gòu)精修。第四十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第五節(jié)溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的研究方法一.紫外吸收法二.熒光光譜法三.圓二色性第四十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期二第六節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)Proteome一詞由MarcWilkins于1994年在ItalySiena的一次2-DE電泳會議上首次提出的。Proteome,源于PROTEin與genOME的雜合，1995年文獻中首次公開使