蛋白質(zhì)雙向電泳原理方法應(yīng)用

蛋白質(zhì)雙向電泳原理方法應(yīng)用第一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二

雙向電泳的實驗原理◆第一向：等電聚焦◆第二向：SDS—PAGE電泳第二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第一向：等電聚焦第三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二向：SDS—PAGE電泳聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺(Arc)和交聯(lián)劑N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速劑N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑硫酸銨（AP）或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為PAGE。第四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二樣品制備基本原則使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品抽提后的化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。第七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳樣品的溶解是成功進(jìn)行雙向電泳的最關(guān)鍵因素之一溶解的目標(biāo)：樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液；必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。第八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二增加樣品溶解性的手段離液劑（變性劑）：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。典型代表是尿素和硫尿。去垢劑（表面活性劑）：經(jīng)過離液劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種去垢劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的去垢劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去垢劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS應(yīng)用最普遍。還原劑：在離液劑和去垢劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進(jìn)行還原。第九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。第十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二聚焦時間的優(yōu)化要獲得高質(zhì)量的圖譜以及很好的試驗重復(fù)性，所需的最佳時間即為等電聚焦達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦最佳時間由不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。第十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二兩維間的平衡等電聚焦電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行第二向電泳，也可于－80°保存數(shù)月。但在第二向電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而使SDS電泳能順利進(jìn)行。建議方案：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris（pH8.8）緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。第十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S安全（safety）：靈敏（sensitivity）：簡單（simplicity）：特異性（specificity）：快速（speed）：穩(wěn)定（stability）：兼容性（synergy）：第十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二適用于質(zhì)譜的染色方法考馬斯亮蘭（Bio-Safe?Coomassie?colloidal250stain）銀染（SilverStainPlus?stain）熒光染色（SYPRO?Rubyproteingelstain）第十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二凝膠的圖像處理分析典型流程凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：第十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳實驗流程

樣品制備（Samplepreparation）固相預(yù)制膠條的水化（IPGstriprehydration）第一向等電聚焦（IEF）膠條的平衡（IPGstripequilibration）第二向SDS電泳（SDSelectrophresis）凝膠的染色及檢測（Detection/Staining）PDQuest軟件分析（Softwareanalysis）質(zhì)譜鑒定（Proteinidentification）第十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二最高電壓10,000V10–25C溫度控制7,11,17,18,和

24cm的聚焦盤，可以各放12根膠條可以儲存10個程序，每個程序有10步程序可進(jìn)行時時編輯可供選配的打印機第十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。第十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。第二十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。第二十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二等電聚焦的操作1.取出IPG預(yù)制膠條（7cmpH4-7），室溫平衡。2.在聚焦盤或水化盤中加入樣品（圖1）。3.去除預(yù)制IPG膠條上的保護(hù)層（圖2）。4.將IPG膠條置于聚焦盤或水化盤中（圖3）。5.在每根膠條上覆蓋1ml礦物油。6.對好正、負(fù)極，蓋上蓋子。7.設(shè)置等電聚焦程序。第二十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的平衡冰箱中取出的膠條，于室溫放置10分鐘。配制膠條平衡緩沖液I。吸去膠條上的礦物油及多余的樣品。第一次平衡。振蕩15分鐘。配制膠條平衡緩沖液II。第二次平衡，振蕩15分鐘。吸去玻璃板中液體。將玻璃板倒扣在桌面上。瓊脂糖封膠液進(jìn)行加熱溶解。配制1×電泳緩沖液。第二十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。第二十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。第二十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第二十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。第三十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第三十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。第三十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第三十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膠條的轉(zhuǎn)移平衡結(jié)束后，先將IPG膠條完全浸末于1×電泳緩沖液中，然后將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上（圖4、圖5）。將放有膠條的SDS凝膠轉(zhuǎn)移到灌膠架上，在凝膠的上方加入低熔點瓊脂糖封膠液（圖-6）。用鑷子、壓舌板或是平頭的針頭，輕輕地將膠條向下推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸（圖-7）。放置5分鐘，使低熔點瓊脂糖封膠液徹底凝固。第三十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二SDS電泳1.在低熔點瓊脂糖封膠液完全凝固后。將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽中。2.在電泳槽加入電泳緩沖液后，接通電源，起始時用的低電流（5mA/gel/7cm），待樣品在完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流（15-20mA/gel/7cm），待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時即可停止電泳。3.電泳結(jié)束后，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記號（戴手套，防止污染膠面）。第三十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用第三十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第三十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳技術(shù)在病原微生物致病機理研究中的應(yīng)用第三十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二

雙向電泳技術(shù)在人類惡性腫瘤研究中的進(jìn)展人們通過雙向電泳技術(shù)分離正常組織細(xì)胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進(jìn)展。腫瘤發(fā)生的早期常常無任何癥狀，而只有在轉(zhuǎn)移時才容易被發(fā)現(xiàn)，這往往導(dǎo)致延誤了治療的最佳時期。因此找到腫瘤早期的標(biāo)志物進(jìn)行及時的診斷和治療顯得尤為重要。

第三十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二雙向電泳技術(shù)在藥物作用機制研究的進(jìn)展

雙向電泳技術(shù)的出現(xiàn)，為動態(tài)、高通量的研究藥物作用機制提供了強有力的方法支持。雙向電泳技術(shù)的另一應(yīng)用就是研究藥物的毒理作用。比較正常細(xì)胞與藥物處理后細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度變化，可以提示藥物的毒性作用機制。細(xì)胞在施藥之后的代謝反應(yīng)做出實時的檢測，不僅能確定療效，也能針對毒性代謝物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)而對藥物進(jìn)行直接的改良，是一項意義深遠(yuǎn)的發(fā)現(xiàn)。第四十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二Westernblot原理方法及應(yīng)用第四十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二定義印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。WesternBlot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。第四十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二什么是蛋白質(zhì)印跡法？Westernblot法是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠已分離的區(qū)帶并印跡于固化紙上，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測定3個階段。Westernblot法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測定的方法。第四十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二WesternBlot基本原理

WesternBlot：采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。第四十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二WesternBlot一般流程第四十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二蛋白樣品的制備第四十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二蛋白樣品制備的注意事項：細(xì)胞數(shù)量達(dá)5×106個時就可以做WB。將細(xì)胞裂解液再離心，收集上清液測蛋白濃度（Bca法）,統(tǒng)一上樣量加loadingBUFFER煮樣5min-10min煮沸5-15min，以充分變性蛋白，保證蛋白從空間結(jié)構(gòu)變?yōu)橐患壗Y(jié)構(gòu)（多聚體解散為單聚體，氧化狀態(tài)轉(zhuǎn)化為還原狀態(tài)等）。有的也可以在700C加熱5-10min，尤其適用于多次跨膜蛋白的檢測（這些蛋白在煮沸狀態(tài)下容易聚集，而聚集狀態(tài)則會影響標(biāo)本進(jìn)入凝膠的效率。）第四十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：SDS是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng)SDS與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性胺基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和SDS的平均結(jié)合量是1:1.4(以重量為單位),而蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后,由于SDS帶強負(fù)價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價一致(chargedensity),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素第四十八頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二第四十九頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二凝膠成份純凈水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺（Arc-Bis）SDSTris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合）過硫酸銨(APS)（提供引發(fā)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合的自由基）第五十頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜膜的選擇聚偏二氟乙烯膜（PVDF）硝酸纖維素膜（NC）需要用甲醇浸泡簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格便宜第五十一頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二膜的選擇第五十二頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜半干法（用恒流）將凝膠和固相基質(zhì)象三明治一樣加在用緩沖液濕潤濾紙之間，電轉(zhuǎn)10－30min。濕法將凝膠和固相基質(zhì)夾在濾紙中間，浸泡在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中，電轉(zhuǎn)1h或過夜。

第五十三頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜注意事項（一）泡膜： 轉(zhuǎn)膜之前將海綿、膠、膜都用預(yù)冷的轉(zhuǎn)移buffer浸泡20min

（1.凝膠若是沒在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜buffer中浸泡，就會在轉(zhuǎn)膜過程中出現(xiàn)凝膠皺縮，導(dǎo)致出現(xiàn)轉(zhuǎn)移條帶變形。2.PVDF膜具有疏水性，需用甲醇浸泡）

轉(zhuǎn)膜順序：陰極碳板(黑)+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳板（白）轉(zhuǎn)膜條件： 0.4A250V1h-90min冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜

（具體轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)目的蛋白的大小而定；目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，反之則短。）

第五十四頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)膜的注意事項（二）避免直接用手碰雜交膜，使用鑷子。因為手上的蛋白和油脂會影響轉(zhuǎn)膜效率并會使膜臟掉。夾好膜和凝膠后，確定在凝膠/膜和濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完全。第五十五頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二封閉（1h）(封閉時間過短會導(dǎo)致背景過深

)5％脫脂奶粉封閉1h，置于搖床上。封閉前，要用雙蒸水洗3-5min,剪膜第五十六頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二

WesternBlotting操作流程第五十七頁，共六十三頁，編輯于2023年，星期二一抗、二抗孵育把硝酸纖維素濾膜放在密閉塑料盒中，根據(jù)濾膜面積以0.1ml/cm2的量加入一抗溶液與濾膜溫育（