蛋白質(zhì)的通性純化和表征

蛋白質(zhì)的通性純化和表征第一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一一.蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)各個解離基團的pK值與游離氨基酸的不完全相同。短肽的等電點和凈電荷量可以根據(jù)pK值計算，蛋白質(zhì)的等電點要用等電聚焦等方法測定。二.蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量假定某種微量成分只有一個，測出其百分含量后，可用比例式算出最低相對分子質(zhì)量。若測出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對分子質(zhì)量不相同時，可計算兩個最低相對分子質(zhì)量近似的最小公倍數(shù)。第二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一例題：一種純酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含異亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相對分子質(zhì)量。解：按照Leu的百分含量計算，最低MrX1：X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量計算最低MrX2：X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含Leu和Ile不止1個，為了估算Leu和Ile的個數(shù)，首先計算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

這種酶含任何氨基酸的個數(shù)均應(yīng)是整數(shù)，說明該酶至少含有2個Leu，3個Ile，其最低相對分子質(zhì)量為：

7939.42=15878.8或5282.3×3=15846.9第三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一（二）滲透壓法測定相對分子質(zhì)量第四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一（三）沉降分析法測定相對分子質(zhì)量第五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：當一個粒子（生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“Fc”由下式定義：F=m·a=m·ω2r

a—

粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m—

沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。第六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一⒉相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:

由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。

RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。

X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutionsperminute,簡寫成r/min,或rpm）。22第七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場中移動的速度。n若ω用2πn/60表示，則n

X1：離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2：離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S：沉降系數(shù)，時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。例如，動物原生質(zhì)核糖體的沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細胞及細胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術(shù)將他們彼此分開。第八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一⒋沉降速度（sedimentationvelocity）：

對于球形顆粒

Fc=1/6d3(ρp?ρm)ω2X

Ff=3dv當Fc=Ff時1/6d3(ρp?ρm)ω2X

=3ηdv

v=(1/18η)[d2(ρp?ρm)ω2X]Fc：離心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直徑；η：流體介質(zhì)的粘度；ρP：粒子的密度；ρm：介質(zhì)的密度；v：粒子移動的速度從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S也可表示為：

①當ρP＞ρm，則S＞0，粒子順著離心方向沉降。②當ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。2d第九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一5.沉降系數(shù)與物質(zhì)相對分子質(zhì)量:

根據(jù)Svedberg公式，由沉降系數(shù)可以計算出物質(zhì)的相對分子質(zhì)量：

Mr=RTS20,W/[D20,W(1-γρ)]Mr:相對分子質(zhì)量；D20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的擴散系數(shù)；R:氣體常數(shù)；T：絕對溫度；S20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的沉降系數(shù)；γ：偏比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；ρ：溶劑密度第十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一6.沉降時間（sedimentationtime，Ts）:

在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)的定義可得積分得X2:離心轉(zhuǎn)軸至離心管底內(nèi)壁的距離；X1:離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液面之間的距離，那么（t2－t1）用Ts表示：

第十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一7.K系數(shù)（kfactor）:K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是使溶液澄清的一個指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小將粒子沉降的速度愈快。

由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有關(guān)。所以K系數(shù)是一個變數(shù)。通常，離心機的轉(zhuǎn)子說明書中提供的K系數(shù)，都是根據(jù)最大路徑及在最大轉(zhuǎn)速下所計算出來的數(shù)值。利用此公式預(yù)估的離心時間，對水平式轉(zhuǎn)子最適合；對固定角式轉(zhuǎn)子而言，實際時間將比預(yù)估的時間來得快些。

第十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一（四）凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。

若以組分的洗脫體積(Ve)對組分相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lgMr)作圖，可得一曲線，其中主要部分成直線關(guān)系。以此為標準曲線，可以通過測定某一未知組分的洗脫體積，而從標準曲線中查得其相對分子質(zhì)量。在實際應(yīng)用中多以相對洗脫體積Kav(Kav=Ve/Vt)對lgMr作曲線，稱為選擇曲線，曲線的斜率說明凝膠的特性。每一類型的化合物，如球蛋白類、右旋糖酐類、酶與清蛋白類等都有各自特定的選擇曲線。測定時，未知相對分子質(zhì)量的組分應(yīng)位于直線部分為宜。若不在直線部分，可選用另一種凝膠重新試驗。第十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一（五）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子質(zhì)量SDS即十二烷基硫酸鈉是陰離子去污劑，在水溶液中，以單體和分子團的混合形式存在，單體和分子團的濃度與SDS總濃度、離子強度及溫度有關(guān)，為了使單體和蛋白質(zhì)結(jié)合生成蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，需要采取低離子強度，使單體濃度有所升高。在單體濃度為0.5mmol/L以上時，蛋白質(zhì)和SDS就能結(jié)合成復(fù)合物；當SDS單體濃度大于1mmol/L時，與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為1.4gSDS/g蛋白質(zhì)；在低于0.5mmol/L濃度時，其結(jié)合比一般為0.4gSDS/g蛋白質(zhì)。由于SDS帶有大量負電荷，當其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而可利用Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS和疏基乙醇，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，使多肽分成單個亞單位。SDS可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，還引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。此復(fù)合物的流體力學(xué)和光學(xué)性質(zhì)均表明，它們在水溶液中的形狀近似雪茄形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物的短軸相同，約1.8nm，而長軸則與蛋白質(zhì)的Mr成正比。第十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一目前，用SDS研究過的蛋白質(zhì)已有數(shù)百種，均證實此法測定蛋白質(zhì)Mr的可靠性?，F(xiàn)在，市場有標準蛋白試劑出售。測定未知蛋白質(zhì)Mr時，可選用相應(yīng)的一組標準蛋白及適宜的凝膠濃度，同時進行SDS，則可根據(jù)已知Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率和Mr的對數(shù)作出標準曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得Mr。本方法有儀器設(shè)備簡單，操作方便，樣品用量少，耗時少(僅需一天)，分辨率高，重復(fù)效果好等優(yōu)點，因而得到非常廣泛的應(yīng)用與發(fā)展。它不僅用于蛋白質(zhì)Mr測定，還可用于蛋白混合組分的分離和亞組分的分析，當?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)SDS分離后，設(shè)法將各種蛋白質(zhì)從凝膠上洗脫下來，除去SDS，還可進行氨基酸順序、酶解圖譜及抗原性質(zhì)等方面的研究。第十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀（一）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)大小在1-100nm范圍內(nèi)；同種電荷互相排斥；質(zhì)點外圍有水化層。（二）蛋白質(zhì)的沉淀

1.鹽析法

2.有機溶劑沉淀法

3.重金屬鹽沉淀法

4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法

5.加熱變性沉淀法第十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則1.前處理要選擇合適的材料;合適的破碎方法;合適的提取液。2.粗分級分離要方法簡便，處理量大。常用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法，有時可用超過濾或凝膠過濾等方法。3.細分級分離主要使用各種層析、電泳，方法要精心選擇，巧妙配合。后期可用結(jié)晶法。第二十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一五、蛋白質(zhì)的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾(1)透析透析是把待純化的蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸餾水或緩沖液）中進行的，透析液可以更換，直至透析袋內(nèi)無機鹽等小分子物質(zhì)降到最小值為止。原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖等分開。

第二十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第二十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一2.超濾：利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的。超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點是使用不對稱多孔膜根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮、不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和、非變性的物理方法，比其它分離方法有效率更高、更靈活的優(yōu)點。原理：在外力作用下，超濾膜對大分子物質(zhì)的截留主要是篩分作用，決定截留效果的主要是膜的表面活性層上孔的大小與形狀。除了篩分作用外，膜表面、微孔內(nèi)的吸附和粒子在膜孔中的滯留也使大分子被截留?，F(xiàn)在已有各種市售的超濾膜裝置可供選用，有加壓、抽濾和離心等多種形式。濾膜也有多種規(guī)格，他們截留相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)。使用中最需注意的問題是濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，使超濾速度減慢，能被截留物質(zhì)的Mr變小。第二十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第二十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一超濾的主要應(yīng)用：濃縮：使用超濾來增加所需大分子溶質(zhì)的濃度，即大分子被超濾膜截留而小分子和溶劑可自由通過，從而達到濃縮的目的。第二十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一梯度分離：按分子大小梯度分離樣品中的溶質(zhì)分子時，超濾是一種經(jīng)濟有效的方法，適用于分離相對分子質(zhì)量相差10倍以上的分子組分。在超濾過程中，雖然截留的大分子被濃縮，但濾過的溶質(zhì)分子仍保持初始的濃度。第二十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一脫鹽／純化：脫鹽即從大分子溶液中去除鹽、非水性溶劑和小分子物質(zhì)的過程。通過溶劑交換，可最有效地去除溶液中的小分子物質(zhì)，并逐漸分離純化出大分子物質(zhì)。具體方法為：在溶液進行超濾的同時，不斷向溶液中補充溶劑，補充溶劑的速度與溶液濾過速度相同，使體系始終保持恒定，這種方法又稱透析超濾法。第二十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一2.密度梯度離心第二十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第二十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一3.凝膠過濾當含有各種組分的樣品流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不易進入凝膠顆粒的微孔，沿凝膠顆粒的間隙以較快的速度流過凝膠柱。而小分子物質(zhì)能夠進入凝膠顆粒的微孔中，向下移動的速度較慢，從而使樣品中各組分按相對分子質(zhì)量從大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。第三十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一樣品中各組分的流出順序，可用分配系數(shù)Ka來量度：

Ka=(Ve-Vo)/Vi式中Ve：為洗脫體積(elutionvolume)，表示某一組分從層析柱洗出到最高峰出現(xiàn)時，所需的洗脫液體積；Vo：外體積(outervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積。Vi：內(nèi)體積(innervolume)，為層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部微孔的體積。當某組分的Ka=0時(即Ve=Vo)，說明該組分完全不進入凝膠顆粒微孔，洗脫時最先流出。若某組分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)時，說明該組分可自由地擴散進入凝膠顆粒內(nèi)部的微孔中，洗脫時，最后流出。Ka在0-1之間的組分，洗脫時Ka值小的先流出，Ka值大的后流出。

第三十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(二)利用溶解度差別的純化方法1.等電點沉淀和pH控制利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低以及不同的蛋白質(zhì)具有不同等電點一這特性，對蛋白質(zhì)進行分離純化的方法稱為等電點沉淀法。在等電點時，蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零，消除了分子間的靜電斥力，但由于水膜的存在，蛋白質(zhì)仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等電沉淀法經(jīng)常與鹽析法或有機溶劑沉淀法聯(lián)合使用。單獨使用等電點法主要是用于去除等電點相距較大的雜蛋白。在加酸或加堿調(diào)節(jié)pH的過程中，要一邊攪拌一邊慢慢加入，以防止局部過酸或過堿。第三十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一2.蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析定義：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；而當鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析作用。在同一濃度的鹽溶液中，不同蛋白質(zhì)的溶解度不同，借此可達到彼此分離的目的。

原理：鹽濃度增高到一定數(shù)值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間相互聚積并從溶液中析出。第三十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第三十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一鹽能夠改變蛋白質(zhì)的溶解度，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強度有密切關(guān)系。兩者的關(guān)系可用下式表示：

lg（S/So）=-KsIS為蛋白質(zhì)在離子強度為I時的溶解度(g/L)；So為蛋白質(zhì)在離子強度為0時的溶解度；Ks為鹽析常數(shù)；I為離子強度。在溫度一定的條件下，某一蛋白質(zhì)在某一pH值的水溶液中的溶解度為一常數(shù)So。故上式可改寫為：

lgS=lgSo–KsI=β–KsIβ=lgSo為一常數(shù)，主要取決于蛋白質(zhì)的性質(zhì)，也與溶液的溫度和pH值有關(guān)；鹽析常數(shù)Ks主要與鹽的性質(zhì)(離子價數(shù)、平均半徑等)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，Ks越大，鹽析效果越好。第三十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一所以對某一蛋白質(zhì)來說，在溫度和pH值等鹽析條件確定(即β確定)，所采用的鹽確定(即Ks確定)以后，蛋白質(zhì)的溶解度決定于離子強度I,I可用下式計算：

I=1/2∑miZi2

mi:溶液中離子的摩爾濃度

Zi：離子的價數(shù)對于多種蛋白質(zhì)或酶的混合液，可采用分段鹽析法進行分離純化。第三十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一鹽的選擇：

蛋白質(zhì)的鹽析通常采用中性鹽，如硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨。

硫酸銨是一中性鹽，對蛋白質(zhì)有相當好的安定作用。又因為其離子容積較大，吸走水分子的能力也大，成為有效的鹽析工具。硫酸銨在水中的溶解度大而溫度的影響小(25℃時溶解度為4.1mol/L，即767g/L;0℃時溶解度為3.7mol/L，即697g/L)，而且價廉易得，不易引起蛋白質(zhì)變性，分離效果比其他鹽好。但是用硫酸銨鹽析時，緩沖能力較差，而且銨離子會干擾蛋白氮的測定，故有時也要用其他鹽來進行鹽析。磷酸鉀和硫酸鈉的鹽析系數(shù)Ks較大，但由于溶解度受溫度影響大，故應(yīng)用不廣泛。第三十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一硫酸銨濃度的計算與調(diào)整方法

通常硫酸銨的添加以百分飽和度來表示(不是濃度百分比)，例如大部分蛋白質(zhì)可在80%硫酸銨飽和度下沉淀。因為硫酸銨加入的體積很大，會改變最后的總體積，很難由濃度百分比來計算，因此使用百分飽和度作為沉淀蛋白質(zhì)的度量。用硫酸銨進行鹽析時，蛋白質(zhì)溶液中硫酸銨濃度的調(diào)整方法主要有二種：（1）加入飽和溶液法要求：蛋白質(zhì)溶液體積不大，所需調(diào)整的硫酸銨濃度不高

V=V0(S2-S1)/（1-S2）

V:所需加進的飽和硫酸銨溶液的體積；V0:原溶液的體積；S2：所需達到的硫酸銨飽和度；S1:原溶液的硫酸銨飽和度。飽和硫酸銨的配制方法：在一定量的水中加入過量的硫酸銨，加熱至50－60℃，趁熱濾去沉淀，再在0℃或室溫平衡1－2天，有固體析出時達100％飽和度。第三十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(2)

加入固體鹽法要求：飽和度高，不增大溶液體積

t=G(S2-S1)/（1-AS2）

S2，S1:分別代表所需達到的硫酸銨飽和度和原溶液的硫酸銨飽和度；t：將1LS1飽和度的溶液提高到S2飽和度時所需加進的硫酸銨克數(shù)；G和A為常數(shù)，與溫度有關(guān)。實際使用時，t可直接查表得到。（注意：0℃，25℃兩張表，室溫用25℃）第三十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一3.pH和溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響pH的影響大多數(shù)蛋白質(zhì)在等點電時，在鹽溶液中的溶解度最低。所以鹽析時溶液pH值調(diào)到等電點效果最好。第四十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一溫度的影響

a.在低離子強度或純水中，溫度升高，溶解度增加；

b.在高鹽溶液中，溫度升高，溶解度降低。一般在室溫下進行鹽析，溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫4℃進行，也有個別酶在低溫時失活，高溫有活性，如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白在25℃比0℃時溶解度低，更容易鹽析。第四十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一4.有機溶劑分級分離法（1）作用機理：（1）降低水溶液的介電常數(shù)，使溶質(zhì)溶解度降低；（2）破壞大分子周圍水膜，使溶解度降低。

利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機溶劑中的溶解度不同而使蛋白質(zhì)分離的方法，稱為有機溶劑沉淀法。經(jīng)常使用的有機溶劑是乙醇和丙酮。（2）優(yōu)點：

比鹽析法析出的沉淀容易過濾或離心分離，分辨力比鹽析法好，溶劑也容易除去。

第四十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一（3）缺點：有機溶劑沉淀法易使蛋白質(zhì)和酶變性，所以操作必須在低溫條件下進行。蛋白質(zhì)和酶沉淀分離后，應(yīng)立即用水或緩沖液溶解，以降低有機溶劑濃度，避免變性。中性鹽可減少有機溶劑引起的蛋白質(zhì)變性，提高分離效果，一般添加0.05mol/L的中性鹽。由于中性鹽會增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，故中性鹽不宜添加太多。有機溶劑沉淀法一般與等電點沉淀法聯(lián)合使用。即操作時溶液的pH值應(yīng)控制在欲分離蛋白質(zhì)的等電點附近。第四十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一注意：（1)低溫操作（2）樣品濃度過大，易變性，共沉淀作用大，分離效果差；過小，易產(chǎn)生變性，回收率低。（3）樣品穩(wěn)定結(jié)構(gòu)范圍內(nèi)，選擇溶解度最低處的pH，即與等電點共沉淀結(jié)合使用。（4)注意離子強度，離子種類的影響。第四十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(三)根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳帶電顆粒在電場中泳動的速度稱遷移率或泳動度(mobility)，可用下式表示：

U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt式中，U(也可以用m表示)為泳動度(cm2/Vs)；v為顆粒泳動速度(cm/s)；E為電場強度(V/cm)；d為顆粒移動的距離；l為支持物的有效長度(cm)；V為實際電壓(V)；t為通電時間(s或min)。電泳后通過側(cè)量V,t,d,l，即可計算出被分離物質(zhì)的泳動度。泳動度與帶電顆粒所帶凈電荷的數(shù)量，顆粒大小和形狀有關(guān)。一般說，凈電荷數(shù)量愈多，顆粒愈小，愈接近球形，泳動度愈大。被分離的球形分子在電場中所受的力(F)為：F=EQ式中，E為電場強度，即每厘米支持物的電位降，Q為被分離物所帶凈電荷。根據(jù)Stoke定律，一球形分子在液體中泳動所受的阻力(摩擦力)F′為：

F′=6πrηv式中，η為介質(zhì)粘度，r為分子半徑，v為分子移動速度。當平衡時：F=F′，即EQ=6πrηv∴v=EQ/6πrη∵U=v/E∴U=Q/6πrη

由上式可見泳動度與球形分子半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶電荷有關(guān)。第四十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第四十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一2.聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱PAGE)。凝膠的聚合常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產(chǎn)生游離氧原子，激活A(yù)cr單體，使其聚合成單體長鏈，在Bis作用下，聚合成網(wǎng)狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5%的凝膠在pH8.8時30min聚合，在pH4.3時約需90min。此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。第四十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第四十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一聚丙烯酰胺凝膠有下列優(yōu)點：(1)在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好。(2)化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(3)對pH和溫度變化較穩(wěn)定。(4)幾乎無電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好。(5)樣品不易擴散，且用量少，其靈敏度可達10-6g。(6)凝膠孔徑可通過選擇單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)。(7)分辨率高，尤其在不連續(xù)凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應(yīng)為一體，因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。PAGE應(yīng)用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。第四十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一3.等電聚焦蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當pH＞pI時帶負電荷，在電場中向正極移動；當pH＜pI時帶正電荷，在電場中向負極移動；當pH=pI時凈電荷為零，在電場中既不向正極也不向負極移動，此時的pH就是該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。各種蛋白質(zhì)由不同的氨基酸以不同的比例組成，因而有不同的pI。利用pI不同，以PAG為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)，在電場作用下，兩性電解質(zhì)載體在凝膠中移動，形成pH梯度，蛋白質(zhì)在凝膠中遷移至其pI的pH處，即不再泳動而聚焦成帶，這種方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(isoelectricfocusing,簡釋IEF)。第五十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第五十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一4.雙向電泳雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經(jīng)第一向電泳分離后，再以垂直它的方向進行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳后樣品中不同組分的斑點基本上呈對角線分布，對提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根據(jù)不同生物分子間等電點及相對分子質(zhì)量不同的特點，建立了以第一向為IEF，第二向為SDS-PAGE的雙向分離技術(shù)，簡稱為IEF/SDS；基本原理與IEF，SDS完全相同。一般第一向IEF用超薄水平板，電泳結(jié)束后切取所需泳道用于第二向電泳，或在1mm內(nèi)徑的毛細管中進行第一向IEF，取出膠條用于第二向電泳。第一向電泳的方法同IEF，只是制膠時要加入2%兩性電解質(zhì)和6mol/L尿素。第二向電泳時，先將SDS-PAG灌在垂直玻璃板之間，上部留2cm左右空間，待聚合后，將第一向膠條轉(zhuǎn)移到第二向膠之上，用載玻片將膠條輕輕壓直，加3μL1%溴酚蘭指示劑，用1%的瓊脂糖(用電極緩沖液配制)密封膠條，瓊脂糖凝固后即可電泳。待溴酚蘭將至凝膠板下方邊緣時，停止電泳。第二向電泳時，用梯度混合器將凝膠制成7.5%-15%的濃度梯度，可以提高電泳的分辨率。第五十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第五十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第五十四頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一5.毛細管電泳

毛細管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis,CGE)是在毛細管中填充具線狀纏結(jié)聚合物結(jié)構(gòu)的物理凝膠，使樣品中各組分通過凈電荷差異和分子大小差異雙重機制得以分離。CGE在蛋白質(zhì)、多肽、DNA序列分析中得到成功應(yīng)用，已成為生命科學(xué)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中有力的分析工具。近年來，其它類型的毛細管電色譜法(capillaryelectro-chromatography,CEC)發(fā)展很快。其中填充毛細管電色譜法(packedcolomnCEC)是將細粒徑固定相填充在毛細管柱中，開管毛細管電色譜法(opentubolarCEC)是把固定相的官能團鍵合在毛細管內(nèi)壁表面而形成的色譜柱。CEC是很有前途的分析方法。由于毛細管容易冷卻，可以加很高的電壓，因而，有很好的分辨率?？梢酝ㄟ^記錄儀直接檢測，容易組合成自動化程度很高的成套儀器。第五十五頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一6.層析聚焦

層析柱中填裝多緩沖交換劑，用多緩沖劑淋洗柱子可以形成pH梯度，淋洗液按照pH依次從柱中流出，蛋白質(zhì)按pI依次從柱中流出，有較好的分離效果。第五十六頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一7.離子交換層析(1)離子交換劑離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(或功能基團)和反離子構(gòu)成的，基質(zhì)與電荷基因以共價鍵連接，電荷基因與反離子以離子鍵結(jié)合。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進行，假設(shè)以RA+代表陽離子交換劑，其中A+為反離子，A+能夠與溶液中的陽離子B+發(fā)生可逆的交換反應(yīng)，反應(yīng)式為：RA++B+RB++A+

第五十七頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一離子交換劑對溶液中不同離子具有不同的結(jié)合力，這種結(jié)合力的大小是由離子交換劑的選擇性決定的。強酸性(陽性)離子交換劑對H+的結(jié)合力比對Na+的??；強堿性(陰性)離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的小得多；弱酸性離子交換劑對H+的結(jié)合力遠比對Na+的大；弱堿性離子交換劑對OH-的結(jié)合力比對Cl-的大。因此，在應(yīng)用離子交換劑時，采用何種反離子進行電荷平衡是決定吸附容量的重要因子之一。離子交換劑與各種水合離子(離子在水溶液中發(fā)生水化作用形成的)的結(jié)合力與離子的電荷量成正比，而與水合離子半徑的平方成反比。所以，離子價數(shù)越高，結(jié)合力越大。在離子間的電荷相同時，離子的原子序數(shù)越高，水合離子半徑越小，結(jié)合力越大。第五十八頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一第五十九頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(2)洗脫方法在離子交換層析過程中，常用梯度溶液進行洗脫，而溶液的梯度則是由鹽濃度或酸堿度的變化形成的。梯度溶液按組成來分，一般有二種：一種是增加離子強度的梯度溶液。是用一簡單的鹽(如NaCl或KCl)溶解于稀緩沖液制成的，習(xí)慣上不用弱酸或弱堿的鹽類；另一種是改變pH值的梯度溶液。該溶液是用兩種不同pH值或不同緩沖容量的緩沖液制成的，所用緩沖液的種類、pH值以及緩沖容量要認真選擇，否則將達不到預(yù)期目的。對于增加離子強度的梯度溶液，不管用于何種類型的離子交換劑，其離子強度絕大部分是增加的。而改變pH值的梯度溶液則不然，如果使用的是陽離子交換劑，pH值應(yīng)從低到高遞增；如果使用的是陰離子交換劑，pH值應(yīng)從高到低遞減，實際許可的pH值范圍由待分離物質(zhì)的穩(wěn)定pH范圍和離子交換劑限制的pH范圍來決定。第六十頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一K=VM/VR第六十一頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(四)利用選擇性吸附的純化方法1.羥基磷灰石層析羥基磷灰石[Ca5(PO4)3OH2(簡稱HA)]的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T＜85℃，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應(yīng)用。有時有些樣品如RNA、雙鏈DNA、單鏈DNA和雜合型雙鏈DNA-RNA等，經(jīng)過一次HA柱層析，就能達到有效的分離。HA的Ca2+基團和生物分子表面的負電荷基團的相互反應(yīng)，在用HA分離生物分子過程中起著重要作用。而HA的PO43-基團與生物分子表面的陽電荷基團的相互反應(yīng)，則僅起著次要的作用。第六十二頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一2.疏水作用層析以苯基瓊脂糖或辛基瓊脂糖為固體支持物，與蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)相互作用，用降低離子強度或增加置換劑的方法洗脫。常用的置換劑有非離子型去污劑、脂肪醇、脂肪胺等。疏水作用層析容易引起蛋白質(zhì)變性，在蛋白質(zhì)分離中使用不廣。第六十三頁，共七十頁，編輯于2023年，星期一(五)利用對配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法

親和層析是利用生物分子間所具有的專一而又可逆的親和力而使生