血紅蛋白的提取與分離

血紅蛋白的提取與分離第一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一思考1分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學的方法分離具有不同物理或化學性質(zhì)的生物大分子。思考2蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對其他分子的親和力等等，可以用來分離不同蛋白質(zhì)。第二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一思考3高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結果是什么被破壞？變性、變性、空間結構思考4人們用雞的紅細胞提取DNA，用人的紅細胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，人的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一一、基礎知識：㈠凝膠色譜法（分配色譜法）：1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類構成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩）2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結構的凝膠的分子篩作用，來進行分離。第四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3、原理：當不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對（）的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。相對分子質(zhì)量較小較長較慢相對分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快小分子穿過多孔凝膠顆粒的內(nèi)部，路程長，流動慢第五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動?；旌衔锷现疵摯蠓肿恿鲃涌煨》肿恿鲃勇占蠓肿邮占》肿?/p>

第六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一第七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一第八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。㈡緩沖溶液：2、作用：能夠抵制（）的對溶液的（）的影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值第九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3、緩沖溶液的配制

通常由（）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（）就可以制得（）使用的緩沖液。1－2使用比例在不同PH范圍內(nèi)

思考：說出人體血液中緩沖對。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3第十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一思考：在血紅蛋白整個實驗室中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結構和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學研究（活性）第十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)（正電荷或負電荷）、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程思考：蛋白質(zhì)為什么帶有電荷？在一定的PH下，蛋白質(zhì)可解離的基團會帶上電荷㈢電泳：第十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一影響蛋白質(zhì)分子運動速度的因素

決定運動方向電場作用力形成阻力決定運動速率電荷性質(zhì)電荷量分子形狀分子大小√√√√√√√第十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離②在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的PH下，這些基團會帶上正電或負電1、原理：第十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲基雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過硫酸銨和催化劑（四甲基已二胺）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠測定（）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量2、常見方法瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳第十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶凈電荷的多少以及分子的大小等因素②原理③

SDS作用為了消除凈電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS,SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種電荷間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于分子的大小十二烷基磺酸鈉（SDS）—聚丙稀酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)分子量①應用第十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一為了消除靜電荷對遷移率的影響可以在凝膠中加入()。SDS能使蛋白質(zhì)發(fā)生完全變性。由幾條肽鏈組成的蛋白質(zhì)復合體在SDS的作用下會解聚成單條肽鏈，因此測定的結果只是()。SDS能與各種蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)—SDS復合物，SDS所帶負電荷的量大大超過了蛋白質(zhì)分子原有電荷量。因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差別，使電泳遷移率完全取決于()。

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移率取決于它所帶靜電荷的多少以及分子的大小等因素。SDS單條肽鏈的分子量分子的大小第十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一電泳檢測PCR結果瓊脂糖凝膠電泳第十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一二實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理——粗分離——純化——純度鑒定第十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細胞中_______細胞數(shù)量最多，細胞的含量最高的有機化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結合的______________________基團。血漿血細胞紅細胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素第二十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一第二十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一1.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色其他血細胞第二十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過程，采取了什么措施？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分攪拌的目的是____________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂第二十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一①目的：去除（）②方法：（）離心（速度越高和時間越長會使白細胞和淋巴細胞等一同沉淀達不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的（），將下層（）的紅細胞液體倒入（）每個肽鏈環(huán)繞（），此基團可攜帶（）。血紅蛋白因含有（）而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動物的血液來分離血紅蛋白。一個亞鐵血紅素基團一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時間黃色血漿暗紅色燒杯第二十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一再加入用（）的（）質(zhì)量分數(shù)為0.9％的氯化鈉溶液洗滌⑤低速離心（低速短時間）⑥重復4、5步驟（）次，直至上清液中已沒有（），表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過少。五倍體積生理鹽水三黃色第二十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一(2)血紅蛋白的釋放

加（）到（）體積，再加40％體積的（）（溶解細胞膜），置于（）上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水第二十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一第1層（最上層）：（）甲苯層第2層（中上層）：（）的沉淀層，（）色薄層固體第3層（中下層）：

（）的水溶液層（）的液體

第4層（最下層）：其它雜質(zhì)（）的沉淀層無色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色第二十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一濾紙過濾脂類物質(zhì)3.分離血紅蛋白分離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機溶劑血紅蛋白第二十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一取()ml的血紅蛋白溶液裝入（）中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的（）中，pH為（），透析12小時，目的是（）或用于更換樣品中的（）。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液4透析(粗分離)1第二十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一第三十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一純化方法－－本實驗采用凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：3.樣品的加入和洗脫第三十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一步驟操作要求①②③④⑤立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h洗滌平衡一次性緩慢倒入；輕輕敲打裝填懸浮液凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹根據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量色譜柱垂直固定在支架上配制懸浮液計算稱量凝膠固定色譜柱材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75

20mmol/L磷酸緩沖液“G”表示什么？75代表什么？2、凝膠色譜柱的裝填第三十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作①取長40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔挖出凹穴安裝移液管頭部覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（），在0.5ml的（）頭部切下（）長的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm第三十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。c.剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在（）上，用（）的尼龍紗將橡皮塞（）包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做（），連接一細的（），并用螺旋夾控制尼龍管的（），另一端放入收集（）的收集器內(nèi)橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管打開與關閉色譜流出液第三十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一⑤安裝其他附屬結構。③頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。第三十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一2）凝膠色譜柱填料的處理（1）凝膠的選擇：（）（G-75）

“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。

75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。（2）方法：配置凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于（）中充分溶脹后，配成（）。蒸餾水凝膠懸浮液交聯(lián)葡聚糖凝膠第三十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一①固定：將色譜柱處置固定在支架上②裝填：將（）一次性的緩慢倒入（）內(nèi)，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法凝膠懸浮液色譜柱注意：凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。第三十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一③洗滌平衡裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在()高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（）12小時。

洗滌平衡注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重新填裝。50cm第三十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3）樣品加入與洗脫①加樣前

打開下端出口，使柱內(nèi)凝膠面上的（）緩慢下降到與（）平齊，關閉出口緩沖液凝膠面第三十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一②加透析樣品第四十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一①調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊②滴加透析樣品：用（）將1ml（）的樣品加到色譜柱的（）③樣品滲入凝膠床：（）④洗脫：打開下端，用磷酸緩沖液洗脫⑤收集：待（）接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每（）收集一試管連續(xù)收集注意正確的加樣操作：

①不要觸及破壞凝膠面②貼壁加樣

③使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動吸管透析液頂端樣品完全進凝膠層5ml紅色的蛋白質(zhì)第四十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3、樣品的加入和洗脫

1.調(diào)液面2.加樣

3.再調(diào)液面

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠注意事項第四十二頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一注意事項1、紅細胞的洗滌：

洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2、色譜柱的裝填：裝完后，立即用緩沖液洗滌、平衡凝膠使裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。3、

凝膠的預處理：

沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡4、色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。

否則容易使白細胞、血小板、淋巴細胞等其他血細胞同紅細胞一塊兒沉淀，而無法將紅細胞分離！第四十三頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。思考第四十四頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（）；然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的（）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行（）。思考樣品的粗分離純化純度鑒定第四十五頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3.SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷（）的蛋白質(zhì)是否達到要求，需要進行蛋白質(zhì)的鑒定。純化第四十六頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一3.SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度（1）試劑的配制①丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺

用去離子水配制29%（29g/100mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N,N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液②十二烷基硫酸鈉（SDS）

用去離子水配成10%的貯存液，于室溫保存。③用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液④TEMED：作用通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。第四十七頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一⑤用去離子水配制10%

過硫酸銨：作用提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。⑥Tris—甘氨酸電泳緩沖液

25mmol/LTris，250mmol/L甘氨酸(pH8.3)，0.1%的SDS。⑦樣品處理液

50mmol/LTris—HCl(pH6.8)，100mmol/LDTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚藍，10%的甘油。⑧染色液

0.1%的考馬斯亮藍R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸⑨脫色液

10%的甲醇和10%的冰醋酸。第四十八頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風櫥內(nèi)或通風處進行。TEMED和過硫酸胺對黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進行電泳操作時一定按照實驗要求和步驟完成。操作時要戴好一次性手套。第四十九頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一①SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備1)根據(jù)廠家說明書安裝電泳用的玻璃板2）SDS—聚丙烯酰胺凝膠制備用去離子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH8.8的Tris緩沖液2.5mL，10%的SDS0.1mL，10%的過硫酸胺0.1mL，TEMED0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高2—3mm），以阻止氧氣進入凝膠溶液。（2）電泳方法步驟第五十頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一③配制SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠溶液。用去離子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH6.8的Tris緩沖液0.5mL，10%的SDS0.041mL，10%的過硫酸胺0.04mL，TEMED0.004mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個操作過程應注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。②分離膠聚合完全后（約30min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。3）樣品處理第五十一頁，共五十七頁，編輯于2023年，星期一5)加樣在電泳樣品