血紅蛋白的提取和分離課件

血紅蛋白的提取和分離課件第一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一知識(shí)回顧--------有關(guān)蛋白質(zhì)的幾個(gè)問(wèn)題：1、含量2、組成元素3、相對(duì)分子質(zhì)量4、基本組成單位：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式：種類(lèi)：5、氨基酸連接方式

占細(xì)胞干重的50％以上，細(xì)胞中含量最多的有機(jī)物C、H、O、N高分子化合物氨基酸RHCCOOHNH2脫水縮合第二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一知識(shí)回顧--------有關(guān)蛋白質(zhì)的幾個(gè)問(wèn)題：6、肽鍵7、分子結(jié)構(gòu)8、蛋白質(zhì)多樣性的原因：(多樣性的根本原因)

9、蛋白質(zhì)的鑒定方法氨基酸肽鏈蛋白質(zhì)脫水縮合盤(pán)曲折疊（n條）CONH氨基酸的種類(lèi)不同；數(shù)目成百上千；排列順序變化多端；多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)千差萬(wàn)別10、生理功能細(xì)胞和生物體的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，是人體發(fā)育和組織更新的主要原料，具有運(yùn)輸、調(diào)節(jié)、免疫、催化等作用，是一切生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者雙縮脲試劑第三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。第五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一本課題的主要內(nèi)容如下：樣品處理及粗分離純化純度鑒定血紅蛋白的提取和分離方法原理方法原理方法原理方法原理凝膠色譜法電泳第六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、基礎(chǔ)知識(shí):樣品處理及粗分離的原理:1、分離生物大分子的基本思路是什么？2、不同蛋白質(zhì)的特性在哪些方面存在差異？3、為什么不用雞的血紅細(xì)胞而用豬的血紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料？4、用什么方法分離相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)？第七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一一、基礎(chǔ)知識(shí)--蛋白質(zhì)提取和分離原理

1、選用一定的物理或者化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。2、形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬(wàn)別。提取分離方法凝膠色譜法

第八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一閱讀并回答（P64）1、凝膠色譜法另一個(gè)名稱(chēng)是什么？2、凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的依據(jù)是什么？3、凝膠的實(shí)質(zhì)是什么？4、凝膠色譜法的原理是什么？

基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法第九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、凝膠色譜法的別名：分配色譜法

是根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的大小分離蛋白質(zhì)的有效方法。3、凝膠實(shí)質(zhì)

①性質(zhì)：一些微小的多孔球體，球內(nèi)含許多貫穿的通道；

②化學(xué)本質(zhì)：多糖類(lèi)化合物：③實(shí)例：葡聚糖、瓊脂糖：基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法2、依據(jù)的特性蛋白質(zhì)分子量的大小。4、原理第十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，相對(duì)（）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（），移動(dòng)速度（），而（）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（）移動(dòng)，路程（），移動(dòng)速度（），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快基礎(chǔ)知識(shí)（一）凝膠色譜法第十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一用凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)時(shí)，分子量大的蛋白質(zhì)A．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較慢B．路程較長(zhǎng)，移動(dòng)速度較快C．路程較短，移動(dòng)速度較慢D．路程較短，移動(dòng)速度較快D第十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)在凝膠中的進(jìn)行過(guò)程可表示為圖中哪一個(gè)B第十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1、之前在什么地方遇見(jiàn)過(guò)緩沖物質(zhì)？2、緩沖物質(zhì)有哪些？作用是什么？3、本實(shí)驗(yàn)加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？（二）、緩沖溶液第十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑組成：作用：抵制外界酸堿對(duì)溶液pH的干擾，保持pH與體內(nèi)環(huán)境基本一致。（二）、緩沖溶液第十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一基礎(chǔ)知識(shí)（三）電泳第十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一閱讀第65頁(yè)的相關(guān)內(nèi)容，回答以下問(wèn)題：1、電泳的概念；2、電泳的原理；3、電泳的種類(lèi)；4、SDS的作用?；A(chǔ)知識(shí)（三）電泳第十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2．凝膠電泳法：(三)電泳1.電泳的概念指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下發(fā)生遷移的過(guò)程.（1）原理：①許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團(tuán)，在一定的PH下，這些基團(tuán)會(huì)帶上正電或負(fù)電。②在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。③電泳利用了待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小，形狀的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。第十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一(三)電泳（2）類(lèi)型：

瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)（3）SDS作用為了消除靜電荷對(duì)遷移率的影響可以在凝膠中加入SDS。電泳結(jié)果陽(yáng)極第二十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過(guò)程中，不同蛋白質(zhì)的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異電泳結(jié)果陽(yáng)極第二十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白血紅蛋白的提取和分離跳轉(zhuǎn)第二十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細(xì)胞中________細(xì)胞數(shù)量最多，紅細(xì)胞的含量最高的有機(jī)化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構(gòu)成的，其中每個(gè)亞基中都含有一個(gè)能與O2和CO2結(jié)合的___________基團(tuán)。血漿血細(xì)胞紅細(xì)胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素返回第二十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一1.洗滌紅細(xì)胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過(guò)程：血液100mL3g檸檬酸鈉低速離心2min紅細(xì)胞血漿吸出血漿紅細(xì)胞5倍體積生理鹽水?dāng)嚢?0min重復(fù)洗滌3次，直至上清液沒(méi)有黃色第二十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一采集得到豬血第二十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一初次離心后的結(jié)果第二十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3次洗滌后的結(jié)果返回第二十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過(guò)程中，在洗滌好的紅細(xì)胞加入了哪些物質(zhì)？為了加速釋放過(guò)程，采取了什么措施？①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分?jǐn)嚢璧哪康氖莀___________________________。使紅細(xì)胞大量吸水脹裂溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜加速紅細(xì)胞的破裂第二十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一(2)血紅蛋白的釋放：

加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯，置于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）,細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。第二十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一磁力攪拌器返回第三十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、粗分離血紅蛋白溶液：①過(guò)程：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10min。②試管中溶液層次：4層。③分離：用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。第三十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第1層（最上層）：甲苯層（無(wú)色透明）第2層（中上層）：脂溶性物質(zhì)沉淀層（白色薄層固體）第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）第4層（最下層）：雜質(zhì)沉淀層（暗紅色）試管中溶液層次返回第三十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一4.透析血紅蛋白第三十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一練習(xí)鞏固1、隨著人類(lèi)跨入蛋白質(zhì)組時(shí)代，對(duì)蛋白質(zhì)的研究和應(yīng)用越來(lái)越深入，首先要做的一步是A弄清各種蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)B弄清各種蛋白質(zhì)的功能C弄清各種蛋白質(zhì)的合成過(guò)程D獲得高純度的蛋白質(zhì)第三十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A調(diào)節(jié)pHB維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng)C防止微生物生長(zhǎng)D防止血液凝固第三十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一樣品處理粗分離純化純度鑒定血液組成成分

1.洗滌紅細(xì)胞

2.釋放血紅蛋白

3.分離血紅蛋白

4.透析血紅蛋白血紅蛋白的提取和分離跳轉(zhuǎn)第三十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一純化－－凝膠色譜操作1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫返回第三十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一裝配好的凝膠柱色譜柱的制作過(guò)程：準(zhǔn)備材料→加工橡皮塞→安裝色譜柱第三十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一（二）凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作：①取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。⑤安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。第四十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一返回第四十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2.凝膠色譜柱的裝填1、凝膠的選擇材料?G代表意義?2、簡(jiǎn)單步驟？3、注意點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)操作（二）凝膠色譜操作1、選擇交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍,75表示凝膠的吸水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水7.5克。2、固定色譜柱－－配凝膠懸液－－裝填色譜柱－－洗滌平衡第四十二頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3、凝膠色譜柱的裝填注意事項(xiàng)：（1）、凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。（2）、裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。（3）、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。（4）、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。第四十三頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.樣品加入與洗脫注意：正確的加樣操作是：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第四十四頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一3.樣品加入與洗脫①調(diào)節(jié)緩沖液面：打開(kāi)下端出口，使柱內(nèi)緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。

②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時(shí)，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動(dòng)加樣，同時(shí)注意不要破壞凝膠面。

③樣品滲入凝膠床：加樣后打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。

④洗脫：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開(kāi)下端出口進(jìn)行洗脫。⑤收集：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過(guò)程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動(dòng)，說(shuō)明色譜柱制作成功）⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)。第四十五頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一收集得到的純化后的血紅蛋白第四十六頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一樣品的加入和洗脫的操作不正確的是A．加樣前，打開(kāi)色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到凝膠面的下面B．加樣后，打開(kāi)下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)C．等樣品完全進(jìn)入凝膠層后，關(guān)閉下端出口D．用吸管小心的將1ml透析后的樣品加到色譜柱的頂端，不要破壞凝膠面A第四十七頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一下列是有關(guān)血紅蛋白提取和分離的相關(guān)操作，其中正確的是（）A．可采集豬血作為實(shí)驗(yàn)材料B．用蒸餾水重復(fù)洗滌紅細(xì)胞C．血紅蛋白釋放后應(yīng)低速短時(shí)間離心D．洗脫液接近色譜柱底端時(shí)開(kāi)始收集流出液

A第四十八頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

觀察你處理的血液樣品離心后是否分層（見(jiàn)教科書(shū)圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過(guò)高和時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1、你是否完成了對(duì)血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？第四十九頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，例如藍(lán)色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說(shuō)明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。第五十頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一

如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話(huà)，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說(shuō)明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。3、你能觀察到蛋白質(zhì)的分離過(guò)程中，紅色區(qū)帶的移動(dòng)嗎？請(qǐng)描述紅色區(qū)帶的移動(dòng)情況，并據(jù)此判斷分離效果？第五十一頁(yè)，共五十六頁(yè)，編輯于2023年，星期一知識(shí)總結(jié)血紅蛋白的提取和分離蛋白質(zhì)分子的差異性凝膠色譜法原理分離過(guò)程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白