三種赤潮藻多克隆抗體制備

海洋科學(xué)集刊孫寧波等：三種赤潮多克降抗體制備及特異性分析PAGE6PAGE7第４９集海洋科學(xué)集刊No.492008年８月STUDIAMARINASINICAAug,2008三種赤潮藻多克隆抗體制備及特異性分析**瑞典國際基金資助項(xiàng)目，IFS/grantSUIA/3864號。孫寧波，碩士，E-mail:sunningbo1221@。通訊作者：隋正紅，教授，suizhengh@。收稿日期：2007年１０月２５日。孫寧波隋正紅包振民王春燕(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與種質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室,青島266003)中國是全球受赤潮危害較重的國家之一（周名江等，2001），隨著現(xiàn)代化工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，沿海地區(qū)人口的增多，大量工農(nóng)業(yè)廢水和生活污水排人海洋，導(dǎo)致近年來赤潮的頻繁發(fā)生和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重破壞了漁業(yè)資源和海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并威脅著人類的生命安全。中國海岸線較長，引起赤潮爆發(fā)的藻種種類多樣，赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)、共生甲藻（Symbiodiniumsp）、鏈狀亞歷山大藻（Alexandriumcatenella）等藻種是常見的赤潮藻，危害較為嚴(yán)重，也是目前研究較多的主要赤潮藻，如何及時(shí)、精確、快速地對赤潮藻進(jìn)定性、定量分析對于預(yù)報(bào)赤潮的發(fā)生、以及赤潮的檢測研究均有重要意義和參考價(jià)值。傳統(tǒng)的赤潮藻定性、定量鑒定主要是通過光學(xué)顯微鏡方法(Hallegraeffetal.,1995)，此方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，對一些個(gè)體微小的藻類難以做出準(zhǔn)確鑒定（Rehnstam-holm,etal.,2002），因此發(fā)展新的檢測技術(shù)成為赤潮研究的緊迫之需。Caron等(2003)用浮游金藻(Aureucoccus．a(chǎn)nophagefferens)成功制備出高特異性的單克隆抗體與多抗血清，并對兩者進(jìn)行了多方面的特性分析。Nakanishi等(1996)利用單克隆抗體制作免疫傳感器定量研究Chatonellmarina,可檢測出100～10000ind/ml密度。向軍儉等（2003）制備了５種赤潮藻單克隆抗體，以抗體為基礎(chǔ)的免疫檢測方法克服了人為因素的影響，具有定性和定量的準(zhǔn)確度。本文作者制備了３種不同粒徑的赤潮藻-赤潮異彎藻、鏈狀亞歷山大藻、共生甲藻的多克隆抗體，采用間接酶聯(lián)免疫法檢測抗體的效價(jià)，采用競爭酶聯(lián)免疫法檢測多克隆抗體的特異性，為進(jìn)一步的的開拓赤潮準(zhǔn)確定性、定量檢測提供依據(jù)，具有深遠(yuǎn)意義。一、材料與方法1.實(shí)驗(yàn)材料赤潮異彎藻、鏈狀亞歷山大藻和共生甲藻藻株均分離自青島膠州灣海域。３種藻均采用f/2培養(yǎng)基（亓海剛等，2006）培養(yǎng)，溫度為（20±1℃），光照強(qiáng)度為72μmol/m2·s，采用14h：10h(L/D)的光暗周期，所用新西蘭純種兔由青島市藥檢所提供。2.實(shí)驗(yàn)方法１）免疫原的制備將生長旺盛的藻細(xì)胞培養(yǎng)液用終濃度為2%的甲醛固定過夜，10000r/min，離心10min，收集藻細(xì)胞沉淀。藻細(xì)胞團(tuán)塊用蒸餾水清洗一次，PBS清洗二次，每次均通過離心收集藻細(xì)胞，離心條件均為10000r/min，離心10min。將收集的藻細(xì)胞分裝于1.5ml試管中，甩去殘余水分，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前取出，用滅菌的PBS重新懸浮均勻后方可使用。2）多克隆抗體制備開始免疫之前將處理好的藻細(xì)胞用0.5mlPBS重懸，混勻，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化，乳化程度盡量完全。家兔通過四肢的腋下注射、背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。初次免疫劑量分別為共生甲藻為1×107個(gè)、鏈狀亞歷山大藻1×107和2×105個(gè)和赤潮異彎藻1×107個(gè)細(xì)胞，加強(qiáng)免疫過程中，除佐劑換為弗氏不完全佐劑和免疫劑量減半外，其它步驟不變。免疫原為等體積的PBS藻細(xì)胞懸液和弗氏佐劑的混合物，每間隔十天加強(qiáng)免疫一次，共注射80d。利用肥達(dá)氏反應(yīng)測得兩種抗體的效價(jià)后，放血，收集血液，4℃靜置血塊收縮,2000r/min，離心5min,提取血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?）封閉吸附處理取赤潮異彎藻抗血清100μl，加900μl無菌PBS稀釋，依次與108個(gè)塔瑪亞歷山大藻、108個(gè)共生甲藻的細(xì)胞混合，放置于20℃振動孵育，與每種藻的孵育時(shí)間均為2h，然后12000r/min,離心10min，收集上清，保存?zhèn)溆茫话凑疹愃频姆椒?，換用共生甲藻的抗血清與108個(gè)塔瑪亞歷山大藻、108個(gè)赤潮異彎藻的細(xì)胞混合放置于20℃振動孵育，與每種藻的孵育時(shí)間均為2h，然后12000r/min離心10min，收集上清，保存?zhèn)溆?換用鏈狀亞歷山大藻的抗血清與108個(gè)赤潮異彎藻、108個(gè)共生甲藻的細(xì)胞混合放置于20℃振動孵育，與每種藻的孵育時(shí)間均為2h，然后12000r/min離心10min，收集上清，保存?zhèn)溆谩?）抗血清效價(jià)的測定抗血清效價(jià)的測定主要采用間接酶聯(lián)免疫法（（亓海剛等，2006）。海藻或海藻粗提液包被(105~106ind/m1)，100μl/孔，4℃濕盒過夜；洗板，用0.5%PBST洗3次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體；封閉，用1%的BSA，包被緩沖溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過夜；洗板，0.5%PBST洗3次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體；加入海藻的多克隆抗體梯度稀釋溶液，100μ1/孔，37℃，1.5h；再洗板，用0.5%PBST洗6次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體；加入酶標(biāo)二抗的稀釋溶液，100μl/孔，37℃，1.5h：洗板，0.5%PBST洗6次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體;加入底物OPD溶液，100μl/孔，37℃，15min；2mol/LH2SO；終止反應(yīng)，50μl/孔：酶標(biāo)儀讀取A492值。將滿足條件P(待檢血清)/N(陰性對照血清)>2.1，且P(待檢血清)>0.2的顯色孔判為陽性，并將抗血清的效價(jià)定義為與50%固相抗原結(jié)合時(shí)抗血清的稀釋倍數(shù)。５）多克隆抗體特異性的測定海藻或海藻粗提液包被(105~106ind/m1)，100μl/孔，4℃濕盒過夜;洗板，0.5%PBST洗3次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體;封閉，用1%的BSA，包被緩沖溶液稀釋，120μl/孔，37℃，3h或者4℃過夜；洗板，0.5%PBST洗3次，蒸餾水沖洗2次，甩干殘存液體；加入已知細(xì)胞密度的藻細(xì)胞溶液的梯度稀釋溶液50μl／孔和抗血清的稀釋溶液50μl／孔，37℃，1.5h，0.5％PBST沖洗3遍后加入HRP一羊抗兔IgG，37℃，1．5h，0.5％PBST沖洗3遍，加入OPD顯色液，100L／孔，37℃，15min，2mol/LH2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1）多克隆抗體與自身藻種反應(yīng)效價(jià)的測定圖1~圖3是利用間接酶聯(lián)免疫法對制備的３種多克隆抗體經(jīng)吸附封閉處理前及處理后的效價(jià)進(jìn)行測定結(jié)果。未經(jīng)吸附處理的赤潮異彎藻、共生甲藻效價(jià)分別達(dá)到1:32000、1：10000以上，顯示是高親合力的抗體；吸附處理后的赤潮異彎藻和共生甲藻的抗體效價(jià)達(dá)到1:10000和1：7500以上，經(jīng)過吸附處理后的兩種多克隆抗體的特異性明顯提高，而效價(jià)有所下降。未吸附處理的鏈狀亞歷山大抗體藻抗體效價(jià)達(dá)到1:2500，相比另兩種藻的效價(jià)較低，吸附處理后的鏈狀亞歷山大藻抗體效價(jià)達(dá)到1：1000，也體現(xiàn)出特異性提高的趨勢；雖然吸附處理后效價(jià)比未吸附處理的抗體效價(jià)有所下降，但已經(jīng)能夠滿足試驗(yàn)要求。圖1赤潮異彎藻抗體效價(jià)測定圖2共生甲藻抗體效價(jià)測定圖3鏈狀亞歷山大藻抗體效價(jià)測定2）多克隆抗體特異性的測定利用間接競爭酶聯(lián)免疫法對制備的多克隆抗體的特異性進(jìn)行測定結(jié)果見圖4~圖6。赤潮異彎藻多克隆抗體可以產(chǎn)生競爭抑制作用，并呈現(xiàn)吸光信號梯度，共生甲藻、鏈狀亞歷山大藻、硅藻（Bacillariophytasp）的競爭抑制曲線比較平直，說明它們同赤潮異彎藻多克隆抗體幾乎沒有交叉，隱藻(Cryptophytasp)與赤潮異彎藻的多克隆抗體有一定的交叉反應(yīng)；共生甲藻多克隆抗體可以產(chǎn)生明顯的競爭抑制作用，與赤潮異彎藻、硅藻、隱藻、鏈狀亞歷山大藻無交叉反應(yīng)，特異性好；鏈狀亞歷山大藻多克隆抗體可以產(chǎn)生競爭抑制作用，與共生甲藻、赤潮異彎藻、硅藻、隱藻、塔馬亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)無明顯交叉反應(yīng)，特異性較好。圖4赤潮異彎藻多克隆抗體特異性檢測圖5共生甲藻多克隆抗體特異性檢測圖6鏈狀亞歷山大藻多克隆抗體特異性檢測3.討論研究結(jié)果表明，赤潮異彎藻的抗體效價(jià)較高，這可能是由于赤潮異彎藻細(xì)胞個(gè)體較?。ㄩL8～25μm，寬6～15μm），細(xì)胞相對表面積較大，可以暴露出更多的抗原表位（Linetal.,2003），從而刺激免疫動物產(chǎn)生了更多的抗體；共生甲藻細(xì)胞個(gè)體相對較大（長20～52μm，寬17～44μm），刺激免疫動物產(chǎn)生的抗體效價(jià)相對較低；鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞個(gè)體最大（長20～42μm,寬28～40μm），產(chǎn)生抗體效價(jià)與前兩種藻抗體相比較低，為提高產(chǎn)生抗體的效價(jià)，我們曾經(jīng)用高細(xì)胞劑量免疫，由于該藻產(chǎn)生神經(jīng)毒素，采用高劑量免疫時(shí)家兔死亡，而用低細(xì)胞劑量免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)較低。由于制備的多克隆抗體可能存在交叉反應(yīng)，因此采用封閉吸附的方法去除交叉反應(yīng)，抗體的特異性明顯提高，而效價(jià)則有所下降（Mendoza,etal.,1995）。利用３種藻細(xì)胞制備的多克隆抗體所建立的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測赤潮藻細(xì)胞，該方法靈敏度高，特異性較好；赤潮異彎藻多克隆抗體與隱藻有一定的交叉反應(yīng)，與其它幾種藻細(xì)胞無明顯交叉反應(yīng)，說明異彎藻與隱藻表面存在相似的抗原表位。共生甲藻多克隆抗體與其它幾種藻無交叉反應(yīng)，說明共生甲藻與這幾種藻細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)差異明顯。利用鏈狀亞歷山大藻多克隆抗體對亞歷山大藻屬內(nèi)不同種的檢測，表明該方法可以作為該屬內(nèi)不同種的鑒定方法。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程操作簡便，利于快速檢測并采用多克隆抗體比單克隆抗體效價(jià)要高，雖然單克隆抗體特異性更高但制備難度大，成功率不高，多克隆抗體更有利于大量制備，獲得相應(yīng)的檢測試劑。免疫學(xué)技術(shù)具有特異、靈敏和簡便的優(yōu)點(diǎn)，并且費(fèi)用低，而且技術(shù)較為成熟。因此，應(yīng)用于赤潮的定性、定量研究具有很大的潛力(Sakoetal.,1995)。參考文獻(xiàn)亓海剛，米鐵柱，辛澤毓，李榮秀，于志剛.2006.赤潮異彎藻抗體的制備及酶聯(lián)免疫檢測方法的建立.海洋學(xué)報(bào),28(5):168～171向軍儉，朱小兵，呂頌輝.2003.五種赤潮藻單克隆抗體的制備.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，24(3):103～108周名江，朱明遠(yuǎn)，張經(jīng)．2001.中國赤潮的發(fā)生趨勢合研究進(jìn)展[J]．生命科學(xué)，13(2)：54～59HallegraeffGM,AandersonDM,CembellaAD.1995.ManualonHarmfulMarineMicroalgaeIOCManualsandGuides,UNESCOPublishig,No.33ParisRehnstam-holmAS,GodheA,AndersonAM.2002.MolecularstudiesofDinophysis(Dinophyceeae)speciesfromSewedenandNorthAmerica.[J].Phycologia,41:348～357CaronDA,DennettMR,MoranDM,eta.l,2003.DevelopmentandApplicationofaMonoclonal-AntibodyTechniqueforCountingAureococcusanophagefferens,anAlgaCausingRecurrentBrownTidesintheMid-AtlanticUnitedStates.ApplideandEnvironmentalMicrobiology,5492～5502NakanishiK,KarubeI,HiroischiS,etal,1996.Detectionoftheredtide-causingplanktonChattonellamarinausingapiezoelectricimmunosensor.NanlyticaChimicaActa,325(1-2):73～80LinSJ,FeinsteinTN,ZhangH,eta.l,2003.DevelopmentofanimmunofluorescencetechniquefordetectingPfiesteriapiscicida.HarmfulAlgae,1003,2(3):223～231MendozaH,Lopea-RodasV,Gonztiez-GilS,etal..1995.Theuseofpolyclonalantiseraandblockingofantibodiesintheidentificationofmarinedinoflagellates:species-specificandclone-specificantiseraagainstGymnodiniumandAlexandrium.JournalofExperimentalMarineBiologyandEcology,186(1):103～115SakoY,1995.AdachiMSpecificmonoelonalantibodiesandDNAprobesfortheidentificationofthetoxicdinofloagellategemusalexandrium[A].LASSUSP,ARZULG,EARDEeds.HarmulMarinealgaeBlooms[C].France:LavoisierPairs,77～81Thepreparationandcharacterisationanalysisofpolyclonalanti-bodiesagainstthe4kindsred-tidealgaeSUNNing-Bo,SUIZheng-Hong,BAOZhen-Min,WANGChun-Yan(LaboratoryofMarineGeneticsandBreedingofOceanUniversityofChina，Qingdao266003)ABSTRACTPolyclonalantibodiesagainstthreeredtidealgaewithdifferentsize,Heterosigmaakashiwo,GymnodiniumspandAlexandriumcatenellawereraisedinthisstudy.Blockaffinitytreatmentwasdonetoenhancethespecificityoftheantibodies.Thetiterofthreepolyclonalantibodieswasdeterminedbyindirectenzyme-linkedimmunosorbentassay,andthespecificityagainstpolyclonalantibodywasdeterminedbyindirectcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassy(icELISA).TheresultshowedthatHeterosigmaakashiwoandGymnodiniumspantibodieswithoutblocktreatmentgottiterhigherthan1:32000and1:10000,respectively,anindicatingofhighaffinityantibodies.ThetiterofAlexandrium