蛋白組學(xué)二維電泳演示文稿

蛋白組學(xué)二維電泳演示文稿當(dāng)前第1頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)優(yōu)選蛋白組學(xué)二維電泳當(dāng)前第2頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白質(zhì)染色方法膠內(nèi)：考馬斯亮藍(lán)R-250(CBBR-250)、CBBG-250、銀染、負(fù)染、熒光染料染色以及放射性同位素標(biāo)記等轉(zhuǎn)移到膜（PVDF、硝酸纖維素膜）上：酰胺黑(AmidoBlack)、麗春紅S(PonceauS)當(dāng)前第3頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)（一）考染（考馬氏亮藍(lán)染色）1、考馬氏亮藍(lán)與蛋白質(zhì)反應(yīng)機(jī)理

考馬氏亮藍(lán)（Coomassiebrilliantblue）是一類三苯基甲烷衍生物。分為R-250（紅蘭色）、R-350（紅蘭色）、G-250（藍(lán)綠色），它們與蛋白質(zhì)結(jié)合生成深藍(lán)色復(fù)合物，在464-595nm有吸收峰（595nm最大），且在比較寬的范圍內(nèi)（15-20μg

）掃描峰的面積與蛋白質(zhì)量成線性關(guān)系，因此可在595nm對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量檢測，而且在一定pH條件下，這種染料-蛋白質(zhì)復(fù)合物被完全解聚。

2、考染機(jī)理

膠體內(nèi)染料和溶液中自由擴(kuò)散染料間形成平衡后，溶液中少量自由染料穿透凝膠基質(zhì)，有選擇性地對蛋白質(zhì)進(jìn)行染色，而膠體態(tài)的染料排阻在膠外，阻止了背景的生成。膠內(nèi)蛋白質(zhì)染色的關(guān)鍵是讓蛋白質(zhì)染色，而膠體不染色。當(dāng)前第4頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)CoommassieBrilliantBlueG-250當(dāng)前第5頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)3、考染程序考染程序至少600多種，主要變換是將以下程序中的醋酸換成三氯乙酸、磷酸或高氯酸，但三氯乙酸易使谷氨酸羧基側(cè)鏈不可逆酯化，造成肽譜數(shù)據(jù)復(fù)雜化。

（1）固定：凝膠浸泡于50%乙醇+10%冰醋酸水溶液中，至少1h，可過夜。

（2）染色：凝膠浸泡于染色液中至少2h。染色液組成：45%甲醇+10%冰醋酸+0.25%考馬氏亮藍(lán)G-250，混均過濾。

（3）脫色：多次更換脫色液，直至背景脫凈，稍稍提高溫度可加快脫色。脫色液組成：25%乙醇+8%冰醋酸。

（4）保存：凝膠脫色后水洗掃描備份，用保鮮膜包裹，一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定；長時(shí)間保存需將蛋白點(diǎn)切下，進(jìn)一步脫色后貯于-80℃。當(dāng)前第6頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)4、考染特點(diǎn)

（1）可以獲得無背景或低背景的圖譜；

（2）染色過程需24-48h，所需時(shí)間較長；

（3）靈敏度不高，為100-10ng，只能檢測10-100ng的蛋白質(zhì)，低豐度的蛋白質(zhì)難以顯色。當(dāng)前第7頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)（二）銀染1、原理：堿性銀氨（Ag(NH3)2+）染色法和酸性硝酸銀（AgNO3）染色法。

酸性硝酸銀染色法的原理是一個(gè)照相的過程，凝膠在酸性環(huán)境下與硝酸銀溫育，銀離子附與蛋白質(zhì)表面，然后在堿性環(huán)境下里用福爾馬林還原成金屬銀。

堿性銀氨染色法的原理是用氨水來形成銀氨復(fù)合物，銀氨復(fù)合物與膠內(nèi)SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合，然后在酸性條件下用福爾馬林將銀氨還原成金屬銀。當(dāng)前第8頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)2、特點(diǎn)（1）酸性銀染染色背景淺、容易控制，對酸性蛋白質(zhì)的染色靈敏度稍高，堿性銀染靈敏度稍高，但背景深、不容易控制。

（2）相對于考染，靈敏度高，可達(dá)200pg。

（3）但由于存在戊二醛的特異性反應(yīng)，對下一步的酶切肽譜提取存在困難；增敏過程蛋白質(zhì)被部分提取至膠外。當(dāng)前第9頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)3、程序1.分析型銀染（不能用于質(zhì)譜鑒定）

(1)水洗膠5min；

(2)40%乙醇，10%乙酸固定1hr；

(3)5%乙醇，5%乙酸固定過夜；

(4)水洗20min兩遍；

(5)5%戊二醛

1hr；

(6)水洗30min四遍；

(7)250mL新鮮配制的銀氨液(1mLNaOH與5mL飽和氨水混合再加10mL20%AgNO3)/膠45min；

(8)水洗3min三遍；

(9)1.5mL1%檸檬酸、125μL37%甲醛/膠顯色；

(10)5%乙酸停顯10min；

(11)水洗10min三遍。當(dāng)前第10頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)2.快速銀染（和質(zhì)譜鑒定相匹配）當(dāng)前第11頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)（三）負(fù)染1、特點(diǎn)

（1）負(fù)染能提高SDS膠上蛋白質(zhì)的回收率，常用有銅染、鋅-咪唑染等。負(fù)染色結(jié)果在凝膠表面產(chǎn)生半透明背景，而凝膠顯示黑色背景或相應(yīng)底色，蛋白質(zhì)以透明形式被檢測出來，而且蛋白質(zhì)被很好地保存下來。

（2）顯色過程僅需5-15min

（3）蛋白質(zhì)易從膠上取出，一般用EDTA絡(luò)合金屬離子就可轉(zhuǎn)移出蛋白質(zhì)。

（4）靈敏度15ng

2、原理（鋅-咪唑染料）

咪唑存在時(shí)，自由或弱結(jié)合的鋅離子以鋅-咪唑形式沉淀下來，而大部分鋅離子因與蛋白質(zhì)結(jié)合牢固而留在膠上，從而導(dǎo)致半透明背景上的空白區(qū)域，這就是負(fù)染過程。當(dāng)前第12頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)人肝癌細(xì)胞系MHCC97的部分雙向凝膠電泳鋅染圖譜當(dāng)前第13頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)鋅染程序(1)水洗1min；(2)0.2mol/L咪唑、0.1%SDS溶液10min；(3)0.2mol/L氯化鋅1min；(4)水洗5sec三遍；當(dāng)前第14頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)（四）熒光染色（Cy3和Cy5）1、原理：利用熒光染料對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，在光激發(fā)下產(chǎn)生熒光，通過掃描得到圖象。比如用甲基Cy3與甲基Cy5兩種染料分別對兩個(gè)不同蛋白樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在一塊2-DE膠上進(jìn)行運(yùn)行，由于兩種染料激發(fā)波長不同，掃描時(shí)可得到兩張有差異的圖象，因此可用于差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2、特點(diǎn)

（1）靈敏度250pg與銀染相近，但線性范圍高于銀染。

（2）蛋白質(zhì)被熒光共價(jià)修飾，改變了移動性能，降低了溶解性，導(dǎo)致質(zhì)譜鑒定出現(xiàn)偏差。

（3）不同樣品由于所含蛋白質(zhì)可被熒光修飾的功能基團(tuán)數(shù)不一樣，靈敏度變化不一樣。當(dāng)前第15頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)二維電泳熒光檢測RedCy3GreenCy5當(dāng)前第16頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)（五）SYPRORuby熒光染色基于釕的金屬螯合染料檢測靈敏度0.5－1ng染色速度快，15min可完成線性動態(tài)范圍廣需要紫外或激光檢測系統(tǒng)和質(zhì)譜檢測兼容當(dāng)前第17頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)總結(jié)染色方法靈敏度線性范圍與質(zhì)譜兼容性費(fèi)用硬件要求考染10ng3++++銀染200pg7+++負(fù)染15ng3++++熒光標(biāo)記250pg104

+++++++++++當(dāng)前第18頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)二維電泳的圖象分析當(dāng)前第19頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)圖象分析對雙向電泳圖譜上的這些蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行檢測、定量、比較、分析和歸類主要包括：圖象采集圖象分析：蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測、背景消除、蛋白點(diǎn)匹配、歸一化處理、數(shù)據(jù)輸出數(shù)據(jù)庫的建立當(dāng)前第20頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)圖象采集（imagecollection）透射掃描方式光密度掃描：考染、銀染、負(fù)染激光誘導(dǎo)熒光掃描：熒光染色當(dāng)前第21頁\共有23頁\編于星期六\10點(diǎn)蛋白點(diǎn)檢測（spotdetection）蛋白點(diǎn)定位、點(diǎn)形狀、點(diǎn)豐度參數(shù)設(shè)定：最模糊的點(diǎn)、最小的點(diǎn)、最大的點(diǎn)和膠的背景當(dāng)前第22頁\