第12章熒光分析法課件

光致發(fā)光：物質(zhì)受到光照射時(shí)，除吸收某種波長的光之外還會(huì)發(fā)射出比原來所吸收的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。特點(diǎn)：1）靈敏度高2）選擇性好3）方法簡單快速，用樣量少4）應(yīng)用受限第一節(jié)熒光分析法的基本原理一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜二、熒光與分子結(jié)構(gòu)三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素

一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生1、分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程

基態(tài)+hv→激發(fā)態(tài)光譜中電子能級(jí)可分為二組：1）電子自旋配對(duì)的（電子自旋方向相反，電子的凈自旋S=0，譜線多重性M=2S+1=1）稱為單重態(tài)或單線態(tài)，以S表示。2）電子自旋非配對(duì)的（電子自旋方向相同，其凈自旋S=1，譜線多重性M=3）稱為三重態(tài)或三線態(tài)，以T表示。

激發(fā)單重態(tài)與相應(yīng)的三重態(tài)的區(qū)別在于電子自旋方向不同及三重態(tài)的能級(jí)稍低一些。三重態(tài)壽命較長。2、熒光的產(chǎn)生基態(tài)光輻射激發(fā)態(tài)基態(tài)釋放能量振動(dòng)弛豫（vibrationalrelexation）

處于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰撞，能量傳遞給溶劑分子，電子返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；只能在同一電子能級(jí)內(nèi)進(jìn)行；時(shí)間約為10-12s；使大多數(shù)電子激發(fā)態(tài)處于其最低振動(dòng)能級(jí)上。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（internalconversion）：內(nèi)轉(zhuǎn)換

兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)具有相同的多重性（都是單重態(tài)或都是三重態(tài)，如S2*→S1*，T2*→T1*）。處于激發(fā)單重態(tài)的分子通過振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換，均可返回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)。

熒光發(fā)射處于第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的電子以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上，發(fā)射的光量子稱為熒光。

特點(diǎn)：

1）發(fā)射光量子，且熒光波長總是長于激發(fā)光波長；

2）時(shí)間約為10-9-10-7s；3）熒光譜線有時(shí)呈現(xiàn)幾個(gè)非常接近的峰（電子返回到基態(tài)不能振動(dòng)能級(jí)，能級(jí)差不同，吸收波長不同）；

4）處于基態(tài)不同能級(jí)的電子會(huì)通過振動(dòng)弛豫返回到基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)。外部能量轉(zhuǎn)換（externalconversion）：外轉(zhuǎn)換

溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過程。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)的過程；降低熒光強(qiáng)度。體系間跨越（intersystemcrossing）

處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如S1*的最低振動(dòng)能級(jí)同T1*的最高振動(dòng)能級(jí)重疊，則可發(fā)生體系間跨越（S1*→T1*）。

特點(diǎn)：無輻射躍遷；發(fā)生在不同多重態(tài)之間（S1*→T1*）；含有重原子如溴、碘等的分子，或溶液中存在氧分子等順磁性物質(zhì)容易發(fā)生；使熒光減弱。外轉(zhuǎn)換及體系間跨越使熒光減弱甚至消失。磷光發(fā)射

分子從單重態(tài)以體系間跨越躍遷到三重態(tài)后，再經(jīng)振動(dòng)弛豫回到三重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)，返回至基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)而發(fā)出光輻射，稱為磷光。特點(diǎn)：

1）發(fā)射光量子，磷光波長較熒光更長；

2）時(shí)間較長，10-4-10s，甚至更長；3）光照停止后，可持續(xù)一段時(shí)間；4）在室溫下很少產(chǎn)生磷光。S2S1S0T1吸收發(fā)射熒光發(fā)射磷光系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫能量l2l1l

3

外轉(zhuǎn)換l

2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜（excitationspectrum）：不同激發(fā)波長的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對(duì)效率。繪制：固定發(fā)射波長，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)激發(fā)波長（λex）的關(guān)系曲線，其形狀與吸收光譜相似。熒光光譜（fluorescencespectrum）：在所發(fā)射的熒光中各種波長組分的相對(duì)強(qiáng)度。繪制：固定激發(fā)光波長和強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長（λem）的關(guān)系曲線。熒光分析法通常采用λexmax與λemmax。熒光光譜特征：1、斯托克斯位移（Stokesshift）：熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)光波長的現(xiàn)象。

原因：1）激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換到達(dá)第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)；2）熒光發(fā)射可能使激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)；3）激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子的相互作用。

2、熒光光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)

基態(tài)分子躍遷到不同的激發(fā)態(tài)（如S1*，S2*），吸收不同的波長（如λ1，λ2），所以吸收光譜可能有幾個(gè)吸收帶；但均回到第一激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)后再發(fā)射熒光返回到基態(tài)，所以熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶。3、熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系

蒽的激發(fā)光譜：a峰為S0→S2*形成。b峰由b0、b1、b2、b3、b4組成，為S0→S1*各不同振動(dòng)能級(jí)而形成。

蒽的熒光光譜：包含c0、c1、c2、c3、c4等小峰，為S1*(v=0)→S0各不同振動(dòng)能級(jí)而發(fā)出光輻射所形成。

二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一）熒光壽命和熒光效率熒光壽命（fluorescencelifetime）：除去激發(fā)光源后，分子的熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間，常用τf表示。Ft=F0e-Ktt=τf

時(shí)，F(xiàn)t=(1/e)F0ln(F0/Ft)=t/τf

直線斜率即為1/τf熒光效率（fluorescenceefficiency）：熒光量子產(chǎn)率（fluorescencequantumyield），指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用φf表示。

φf=發(fā)射熒光的光子數(shù)/吸收激發(fā)光的光子數(shù)一般物質(zhì)的熒光效率在0-1之間。大小取決于物質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)及環(huán)境（溫度、pH、溶劑等）。熒光效率越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。

（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)同時(shí)具備兩個(gè)條件：1）有強(qiáng)的紫外-可見吸收2）有一定的熒光效率

長共軛分子→較強(qiáng)紫外吸收

剛性平面結(jié)構(gòu)分子→較高熒光效率{1、長共軛結(jié)構(gòu)具有π→π*躍遷

大多數(shù)產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，π電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度越大，熒光波長也長移。2、分子的剛性-共平面性分子剛性-共平面性越強(qiáng)，熒光效率越大，熒光波長越長。3、取代基

1）給電子取代基，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、-NR2、-CN等，能增加分子的π電子共軛程度，常使熒光效率提高，熒光波長長移。2）吸電子取代基，如-COOH、-NO2、-C=O、-NO、-SH、-NHCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I等，減弱分子的π電子共軛程度，使熒光減弱甚至熄滅。3）取代基對(duì)π電子共軛體系作用較小，如-R、-SO3H、-NH3+等，對(duì)熒光影響也不明顯。（三）熒光試劑

弱/無熒光物質(zhì)+熒光試劑→強(qiáng)熒光產(chǎn)物1、熒光胺（fluorescamine）：特點(diǎn)：與脂肪族和芳香族伯胺形成高度熒光衍生物。熒光胺及其水解產(chǎn)物均不顯熒光。熒光條件：λex=275/390nm，λem=480nm。

2、鄰苯二甲醛（OPA）：特點(diǎn)：在2-巰基乙醇存在下，pH9-10的緩沖溶液中能與伯胺類、特別是半胱氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸外的α-氨基酸生成靈敏的熒光產(chǎn)物。熒光條件：λex=340nm，λem=455nm。例：測定磺胺類藥物3、1-二甲氨基-5-氯化磺酰萘（Dansyl-Cl，DANS-Cl，丹酰氯）：

與伯、仲胺及酚基的生物堿反應(yīng)生成熒光物質(zhì)。丹酰肼（Dansyl-NHNH2）：

與可的松等的羰基縮合，產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。熒光條件：λex=365nm，λem=500nm?！坊幬锏臏y定雌激素的測定→4、測定無機(jī)離子的熒光試劑無機(jī)離子+有機(jī)化合物→配合物→直接測定熒光強(qiáng)度加入無機(jī)離子（如CN-、F-等）配合物熒光減弱或消失熒光猝滅法三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素1、溫度：溫度↑→熒光效率↓，熒光強(qiáng)度↓原因：溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無輻射躍遷增加，從而降低了熒光效率。2、溶劑：

1）溶劑極性：極性↑→熒光波長↑，熒光強(qiáng)度↑原因：極性溶劑中，π→π*躍遷能量差ΔE小，使紫外吸收波長和熒光波長均長移；躍遷幾率增加，使熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。2）溶劑粘度：粘度↓→熒光強(qiáng)度↓原因：溶劑粘度低，分子間碰撞機(jī)會(huì)增加，使無輻射躍遷增加，使熒光減弱。溫度↑→溶劑粘度↓→熒光強(qiáng)度↓3、酸度：熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液的酸度對(duì)其熒光強(qiáng)度有較大影響，因?yàn)樵诓煌岫戎蟹肿雍碗x子間的平衡改變，因此熒光強(qiáng)度也有差異。如苯胺：在pH7-12溶液中主要以分子形式存在，發(fā)生藍(lán)色熒光；pH<2或pH>13的溶液中均以離子形式存在，不發(fā)射熒光。

4、熒光熄滅劑：熒光熄滅：熒光猝滅，指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：引起熒光熄滅的物質(zhì)，如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物。作用機(jī)制：

1）熒光物質(zhì)分子和熄滅劑分子碰撞而損失能量；2）熒光物質(zhì)分子與熄滅劑分子作用生成了本身不發(fā)光的配位化合物；3）溶解氧的存在，使熒光物質(zhì)氧化，或是由于氧分子的順磁性，促進(jìn)體系間跨越，激發(fā)單重態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三重態(tài)；4）濃度較大（超過1g/L）時(shí)，發(fā)生自熄滅現(xiàn)象。熒光熄滅法（fluorescencequenchingmethod）：熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減弱和熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系，利用這一性質(zhì)測定熒光熄滅劑的含量的方法。5、散射光：一束平行單色光照射在液體樣品上時(shí)，大部分光線透過溶液，小部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。

瑞利光：僅運(yùn)動(dòng)方向改變，無能量交換。

拉曼光：運(yùn)動(dòng)方向改變，并有能量交換，波長較入射光稍長或稍短。對(duì)熒光測定干擾的主要是波長比入射光波長更長的拉曼光。消除：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長。6、其它內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)濾光作用，如色胺酸中的重鉻酸鉀。自吸收現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收，如蒽化合物。第二節(jié)熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系溶液的熒光強(qiáng)度

該溶液中熒光物質(zhì)吸收光能的程度

熒光效率條件：極稀溶液

二、定量分析方法1、校正曲線法：

以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)。2、比例法：

在線性范圍內(nèi)，測定標(biāo)樣和試樣熒光強(qiáng)度，對(duì)比。3、聯(lián)立方程式法：

用于多組分混合物的熒光分析。

第三節(jié)熒光分光光度計(jì)

和熒光分析新技術(shù)一、熒光分光光度計(jì)濾光片熒光計(jì)：激發(fā)濾光片讓激發(fā)光通過；發(fā)射濾光片常用截止濾光片，截去所有的激發(fā)光和散射光，只允許試樣的熒光通過，不能測定光譜，只用于定量分析。濾光片-單色器熒光計(jì)：將發(fā)射濾光片用光柵代替，不能測定激發(fā)光譜，可測定熒光光譜。熒光分光光度計(jì)：兩個(gè)濾光片都用光柵取代，可繪制激發(fā)光譜和熒光光譜。1、熒光分光光度計(jì)的主要部件：

激發(fā)光源：氙燈、高壓汞燈、激光

激發(fā)單色器（樣品池前）：光柵或?yàn)V光片

發(fā)射單色器（樣品池后）：光柵或?yàn)V光片

樣品池：石英