高效液相色譜法的新進展

高效液相色譜法的新進展第一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)高效液相色譜的定義第二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二定義

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各組分在色譜柱內被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。第三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)儀器裝置第四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

所使用的儀器為高效液相色譜儀，基本是由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)采集及處理等幾部分構成。儀器應定期檢定并符合有關規(guī)定。第五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二高壓輸液系統(tǒng)

高效液相色譜輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等。第六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二貯液罐及流動相

貯液罐貯液罐是一個存放流動相（洗脫液）的容器,所以其結構材料必須對流動相是化學惰性的。常用的材料為玻璃、不銹鋼或表面噴涂聚四氟乙烯的不銹鋼等。容積一般為0.5～2升。第七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

流動相流動相的配制應首選色譜純試劑，水應用純化水。流動相使用前應先用0.45μm或更小孔徑微孔濾膜過濾，目的是除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。其次，流動相進入高壓泵前應脫氣，目的是除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡，如果不去除氣泡，會有以下情況發(fā)生：（1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積；（2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形；（3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動。脫氣的方法有加熱法、加壓法、超聲去除法、惰性氣體置換法及在線脫氣法。第八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇—水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時首選乙腈—水系統(tǒng)）。乙腈與甲醇相比較，具有以下優(yōu)點：（1）乙腈洗脫能力較強（40%乙腈約相當于50%甲醇，相當于30%四氫呋喃）；（2）乙腈具有良好的溶解能力，能使色譜峰的峰形更加對稱；（3）乙腈與水能夠較好的互溶，并且黏度較甲醇—水??；（4）乙腈的截止波長是有機溶劑中最低的，高純度乙腈截止波長為190nm。第九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二但同時具有以下缺點：（1）乙腈價格較甲醇昂貴；（2）在低pH條件下，磷酸鹽在乙腈溶液中溶解度較小，有研究表明，當乙腈接近50%（體積分數(shù)）且磷酸鹽緩沖鹽達0.050mmol/L時會生成沉淀，而且這種沉淀是逐步形成的；（3）乙腈不很穩(wěn)定，易與強酸反應，如硫酸；（4）與醇類溶劑相比，乙腈毒性較大，但在正常操作下，基本是安全的。第十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

如經(jīng)試用不適合時，再選用其它溶劑系統(tǒng)。如在上述二元流動相中加入少量的四氫呋喃，能夠改善某些難分離的物質的分離度，還可加入少量有機堿類（如三乙胺等）可改善色譜峰峰拖尾現(xiàn)象。應盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。另外，由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。第十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二高壓輸液泵

高壓輸液泵是高效液相色譜儀中的關鍵部件之一。它將洗脫液在高壓下連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。在高效液相色譜儀中,對高壓輸液泵的性能有如下要求：

1.流量穩(wěn)定。為使色譜過程具有良好的重現(xiàn)性,泵的輸出流量要恒定。其流量精度為1%左右。

2.輸出壓力高。由于色譜柱填料顆粒細,為使洗脫液以一定的流速流過色譜柱,泵必具有一定輸出壓力。不同的儀器，所使用的輸出壓力單位不同，最高的輸出壓力為500kg/cm2。另外,輸出壓力應平衡,脈動小,有利于降低檢檢測器的噪音,提高信噪比和柱效。第十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二3.流量范圍寬。流量可調范圍大,一般在0.01～10ml/min范圍內任選。

4.耐酸、堿緩沖液腐蝕。

5.泵體易于清洗。具有梯度洗脫功能，操作方便，容易維修。第十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

目前在高效液相色譜儀中所采用的高壓輸液泵,按排液性質可分為恒壓泵和恒流泵;按工作方式又可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復柱塞泵四種。前兩種為恒壓泵,后兩種為恒流泵。目前在高效液相色譜儀上采用最廣泛的為往復柱塞泵。第十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

由驅動機構(馬達、減速器、驅動凸輪)帶動的小柱塞(φ3～4mm),在以密封環(huán)密封的液缸內，以每分鐘數(shù)十次至一百多次的頻率作往復運動。當小柱塞自液缸內抽出時,出口單向閥由于管路中液體的外壓力迫使它關死,液體自入口單向閥吸入液缸;當小柱塞被推入時,入口單向閥關死,液體經(jīng)壓縮自出口單向閥排出,如此周而復始,壓力逐漸上升。泵的輸出流量,可借柱塞往復運動的沖程或馬達的轉速來調節(jié)。由于泵的柱塞往復運動的頻率較高,所以對密封環(huán)的耐磨性及單向閥的剛度和精度要求很高。密封環(huán)一般采用聚四氟乙烯加添加劑材料制造,而單向閥的球、閥座及柱塞桿則用人造紅寶石材料。第十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

往復柱塞泵因為它的液缸容積小,易于清洗和更換溶劑系統(tǒng),因此特別適合于梯度淋洗,現(xiàn)已廣泛應用于高效液相色譜中。但由于泵體本身的結構,決定了它的輸出壓力是隨柱塞運動位置的變化而變化的,因此輸出壓力有明顯的起伏脈動。為了克服此缺點,目前儀器中使用的泵,大致用以下幾種方法減少它的壓力脈動。①采用多頭泵(二頭或二頭以上)交替聯(lián)動②壓力脈動阻滯器③改進驅動凸輪的幾何形狀第十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二梯度洗脫裝置

梯度洗脫,又稱溶劑程序。在色譜分離過程中,洗脫液的組成按一定的速率連續(xù)改變,其作用相當于氣相色譜中的程序升溫。由于液相色譜中洗脫液的極性變化直接影響樣品組分的保留值(或k’值),因此梯度洗脫可改善復雜樣品的分離度,縮短分析周期,改善峰形和提高樣品的最小檢測量。一般在液相色譜中,梯度洗脫比程序升溫、流速程序、重復分離和聯(lián)用柱等幾種方法有效得多。梯度洗脫裝置可分為以下兩類:第十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二第十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二1.低壓梯度洗脫裝置低壓梯度又稱外梯度。它是一種在常壓下洗脫液按預先規(guī)定的比例混合后,再由高壓泵輸入色譜柱,所以也稱為泵前混合。最簡單的低壓梯度裝置。是利用兩個直角三角形容器,其幾何位置不同,兩種洗脫液的混合比例曲線也不同。由于其重復性差,現(xiàn)已很少采用。電磁比例閥的開關頻率,由控制器控制。改變控制器程序,即可得到任意混合濃度的曲線。第十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二2.高壓梯度洗脫裝置高壓梯度又稱內梯度。它是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的梯度洗脫裝置。常見的一種是由兩臺高壓泵、梯度程序控制器、混合器等部件組成。兩臺泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器,經(jīng)充分混合后進入色譜柱。這是一種泵后高壓混合形式。高壓梯度所采用的泵,多為往復柱塞泵或螺旋泵。由此所獲得的流量精度高,梯度洗脫曲線重復性好。梯度洗脫的溶劑混合器應具備容積小、無死區(qū)、清洗方便、混合效率高等性能，才能獲得重復的、滯后時間短的梯度洗脫曲線。第二十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二3.注意事項（1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差；（2）梯度混合的溶劑互溶性要好；（3）梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）。第二十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二進樣系統(tǒng)

進樣系統(tǒng)是將被分析試樣導入色譜柱的裝置。對于液相色譜的進樣裝置，要求重復性好，死體積小，保證中心進樣,進樣時對色譜柱系統(tǒng)流量波動要小，便于實現(xiàn)自動化等。進樣系統(tǒng)包括取樣、進樣兩個功能,而實現(xiàn)這兩個功能又分手動和自動兩種方式。第二十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二柱溫箱

柱溫箱為放置色譜柱的地方，一般可以存放1～3根色譜柱。應用柱溫箱可以保持色譜柱溫度，不受外界環(huán)境影響，主要表現(xiàn)為分析結果重現(xiàn)性好、提高柱效、降低柱壓、保證檢測穩(wěn)定性。較為先進的柱溫箱不但可以保持較高溫度（80～100℃），也可以保持較低溫度（低于室溫10℃），同時可設置溫度程序控制。第二十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二色譜柱

色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件，要求分離度高、柱容量大、分析速度快。要達到如此好的性能，不僅與固定相本身的性能有關，而且與色譜柱結構、裝填和使用技術等有關。第二十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二色譜柱的使用及保養(yǎng)1.使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當?shù)恼{整。當對其測定結果產(chǎn)生爭議時，應以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結果為準。

2.以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱使用溫度，但不宜超過60℃。第二十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二檢測器

高效液相色譜法具有高效、高速、高靈敏度的特點。微量組分經(jīng)色譜柱分離后的檢測既不能用人的肉眼也不能分段取樣后用儀器檢測，只能采用檢測器在色譜柱后直接檢測。樣品組分洗脫液中的濃度或物理量變化，由檢測器連續(xù)地轉換成電信號，在記錄儀上迅速地給出直觀的信息。操作者可按照所描繪的色譜峰位置來定量地判斷分離情況的優(yōu)劣,并根據(jù)峰面積定量地測定各組分的含量。第二十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。第二十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二餾分收集器

如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做了其他波譜鑒定,或獲得少量試驗樣品的小型制備，餾分收集是必要的。用小試管收集、手工操作，只適合于少數(shù)幾個餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯。餾分收集器比較理想，因為便于用微處理機控制，按預先規(guī)定好的程序，或按時間，或按色譜峰的起落信號逐一收集和重復多次收集。第二十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二數(shù)據(jù)采集及處理

把檢測器的信號轉換為色譜圖，一般采用色譜積分儀及色譜工作站進行。積分儀較為簡單，可以設定積分參數(shù)，記錄保留時間、峰號以及峰面積，但是分離度和理論板數(shù)需手工計算，偏差較大；積分儀可儲存少量色譜圖，但關機后儲存的色譜圖即不再保存；積分儀記錄介質多為熱敏紙，保存時間較長后顏色消退，需另行復印后保存。第二十九頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

目前大部分高效液相色譜儀數(shù)據(jù)采集多用色譜工作站。較為簡單的色譜工作站一般為國內開發(fā)，價格較為便宜，但只能進行數(shù)據(jù)采集，色譜條件只能由儀器設定。相對于積分儀來說，由于使用計算機控制，色譜圖比較一目了然，改變積分參數(shù)后，可清晰看出色譜圖的變化；可以進行分離度、理論板數(shù)等簡單計算。第三十頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二第三節(jié)檢測方法第三十一頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二紫外檢測法

紫外檢測法是高效液相色譜中最常用的檢測方法。由于有機化合物中近百分之八十都具有紫外吸收，因此紫外檢測器的應用最早也最廣。這種檢測器具有很高的靈敏度，對環(huán)境溫度及流速波動不甚敏感，適用于梯度洗脫操作。但是紫外檢測器一次只能得到一個波長的色譜圖，而二極管陣列檢測器可以采集三維圖譜，針對每一個色譜峰可以進行光譜掃描，進行峰純度測定。第三十二頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二電化學檢測法

高效液相色譜中的電化學檢測法，是利用電化學固有的靈敏度對洗脫液中痕量電活性物質進行定性定量分析，既具有寬的線性動力學測定范圍(106)及高的靈敏度(10-12g)，可與熒光檢測法相比，又可用于色譜行為相似而電化學性質不同的化合物的測定，更具有專屬性。因此，在藥物分析中，高效液相色譜電化學檢測法，主要應用于復雜樣品中痕量組分的選擇測定，以及較復雜生物樣品中藥物及其代謝物的測定。第三十三頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二第五節(jié)色譜儀常見故障的分析和排除方法第三十四頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

在高效液相色譜的應用中，故障主要出現(xiàn)在壓力異常、漏液、保留時間漂移、基線漂移及噪聲、峰形異常等幾個方面。故障的起因是多方面的，在儀器的每一環(huán)節(jié)都有可能出現(xiàn)化學或者機械上的問題。而準確地分析故障的原因所在和及時地排除故障，除專業(yè)維修人員外，對實驗者來說也是應當了解的。下面就以上五個方面的故障進行分析，簡單的故障可自己動手排除。第三十五頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二壓力異常

（一）無壓力表現(xiàn)為無壓力，流動相不流動。電源問題柱塞桿折斷泵頭內有空氣或流動相不足單向閥損壞漏液壓力傳感器損壞（流動相流動正常，但無壓力）。第三十六頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二（二）壓力持續(xù)偏高或不斷上升流速設定過高保護柱或色譜柱篩板堵塞流動相使用不當或有緩沖鹽析出色譜柱選擇不當進樣閥損壞線路過濾器堵塞第三十七頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二（三）壓力持續(xù)偏低流速設定過低色譜柱選擇不當柱溫過高系統(tǒng)漏液第三十八頁，共四十七頁，編輯于2023年，星期二

（四）壓力波動泵頭中有氣泡單向閥損壞柱塞密封圈損壞脫氣不充分系統(tǒng)漏液使用