關(guān)于中藥生物指紋圖譜的調(diào)研報告

中藥生物指紋圖譜調(diào)研報告一、中藥生物指紋圖譜簡介中藥生物指紋圖譜（biologicalfingerprintofTCM）是利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究藥材基因型特征和中藥作用于特定生物細胞后引起基因和蛋白的表達的變化規(guī)律和作用機制，從分子水平上揭示中藥、中藥與生物的細胞作用后的基因與蛋白的表達特征，研究解決化學(xué)成分和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性，是中藥指紋圖譜研究的一個重要方面和最高級階段。主要包括中藥基因組學(xué)指紋圖譜、中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜和中藥材DNA指紋圖譜[1]。目前，由于宏觀上中藥作用靶點和作用機制的多樣性及對基因作用的多樣性，中藥基因組學(xué)指紋圖譜和蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜可反映中藥制劑作用于某特定細胞或動物后所引起的基因或蛋白的特定構(gòu)象的復(fù)雜變化情況。這兩種指紋圖譜可稱為生物活性指紋圖譜。這種指紋圖譜不但包含了化學(xué)信息，也體現(xiàn)了和此相關(guān)的藥效、臨床療效等生物醫(yī)藥信息，通過比較不同蛋白質(zhì)、基因指紋圖譜體現(xiàn)的不同藥效結(jié)果，就可確定何種物質(zhì)基礎(chǔ)(化學(xué)成分群)是該中藥制劑的最佳方式，而且為解決中藥研究中缺乏標(biāo)準品的難題提供了一條可行之路[1]。目前，中藥基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)指紋圖譜的研究工作正在開展。中藥蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)指紋圖譜可從分子水平上豐富整個中藥指紋圖譜研究體系。無論是中成藥二次開發(fā)，還是中藥新藥研究，都有一個關(guān)鍵問題需要解決--逐步在分子水平上研究解決化學(xué)成分(物質(zhì)基礎(chǔ))和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性。而其中，通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究得到的蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜又具有很高的說服力。中藥材DNA指紋圖譜多運用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同生物樣品中人工合成DNA片段,這種DNA片段的大小、數(shù)目因不同生物而異,因而稱之為DNA指紋圖譜。由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析的是生物遺傳因子而非表現(xiàn)型,所以結(jié)果可不受環(huán)境因素、樣品狀態(tài)和材料來源等外界條件的影響,因此為中藥品種鑒別中極為可靠的手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,已有文獻報道用DNA指紋圖譜作為藥材的鑒定方法.李曉波[2]等人的研究預(yù)示DNA指紋技術(shù)正在逐漸成為中藥鑒定的一種新方法。DNA指紋圖譜由于其特點，無法客觀反映藥用植物因外部環(huán)境影響基因表達造成的藥效成分含量的差異，只能用于藥材種質(zhì)資源的考察。對于DNA指紋技術(shù)在中藥材鑒定方面的推廣和普及的關(guān)健是降低檢測成本和簡化操作過程。目前，應(yīng)用于中藥質(zhì)量研究的DNA分析技術(shù)主要有分子雜交和PCR兩方面。前者有以低拷貝序列基因為對象的RFLP(限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性),以中度重復(fù)序列為對象的衛(wèi)星DNA指紋圖，后者有RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)，AFLP(擴增片斷長度多態(tài)性)和DNA測序等。二、中藥生物指紋圖譜應(yīng)用中藥譜效關(guān)系研究彌補了目前以化學(xué)指紋圖譜控制中藥質(zhì)量時與藥效脫鉤的不足，可為中藥質(zhì)量控制提供更為科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。但是中藥譜效關(guān)系研究需要制備足夠量的樣品開展藥理實驗，因此不適于中藥復(fù)雜體系效應(yīng)成分的高通量篩選與確證。為此，高通量篩選中藥效應(yīng)成分的生物指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)為中藥有效性評價提供了另一思路和方法。生物色譜法是應(yīng)用最早的生物指紋圖譜技術(shù)，包括分子生物色譜、生物膜色譜和細胞生物色譜等，其基本原理是將生物大分子或靶體甚至細胞(酶、受體、DNA、仿生物膜、細胞等)固著于色譜擔(dān)體上，作為一種生物活性填料用于液相色譜，形成一種能夠模擬藥物與生物大分子、靶體或細胞相互作用的色譜系統(tǒng)，這樣就可以利用色譜參數(shù)快速、精確、穩(wěn)定地表征藥物與生物大分子靶體或細胞間的相互作用。由于能與生物體系發(fā)生相互作用是化學(xué)成分發(fā)揮藥效的前提，因此可借此從復(fù)雜的中藥化學(xué)成分中篩選潛在的效應(yīng)成分(組)。例如，孔亮等[3]根據(jù)不同藥物與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合力的差異，應(yīng)用HSA分子生物色譜分析中藥活性成分。在相同的色譜條件下，用HSA柱分別分離了當(dāng)歸、黃芪、川芎和赤芍四種單味中藥的水提物，發(fā)現(xiàn)它們的分離情況各有特征。當(dāng)歸、黃芪譜圖中各有4個明顯的保留組分，赤芍譜圖中有2個保留組分。與HPLC相比，HSA分子生物色譜排除了大量非作用成分的干擾，同時，與HSA的相互作用可表征化學(xué)成分在體內(nèi)的分布、代謝及排泄等過程。為此，HSA分子生物色譜法可用于篩選中藥中可能的生物活性成分。目前，對中藥生物指紋圖譜的研究開展較少，較成熟的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）同工酶法和隨機擴增多態(tài)DNA技術(shù)（RAPD）等方法。石俊英等［4］在國內(nèi)首先將PAGE法應(yīng)用于植物、動物類中藥材的真?zhèn)舞b別。DNA指紋圖譜技術(shù)比傳統(tǒng)的四大鑒別方法更為準確、客觀，適用范圍更廣，非常適合于近緣種、易混淆品種、珍稀品種、動物藥材、破碎藥材、陳舊藥材、腐爛藥材及樣品量極為有限的植物模式標(biāo)本、中藥出土標(biāo)本、古化石標(biāo)本等珍貴樣品的鑒定[5]。它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種)，而且可以檢測外型極為相似的同種中不同變種、變型、品系、乃至個體之間的DNA的細微變異。這一技術(shù)近年來正越來越廣泛地被應(yīng)用于中藥材鑒別，道地藥材的鑒定以及動、植物中藥種質(zhì)資源和遺傳育種的研究中,并且取得了令人矚目的成果。Mizukami比較分析了當(dāng)歸Angelicaacutiloba(Sieb.etZucc.)Kitag.、三島柴胡Bupleurumfalcatumacut.sin.nonL.和珊瑚菜GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.的5SrRNA基因的間隔區(qū)的堿基序列，針對該DNA片斷的序列差異，選用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化PCR產(chǎn)物，所獲得的圖譜可鑒別此3種藥材[6]。王建云等從雞內(nèi)金類藥材中提取DNA，采用cyt2b基因PCR特異擴增,DNA測序得到約143個堿基的序列片斷，其中36個堿基的差異可以明確區(qū)分外觀十分相似的雞內(nèi)金與鴨內(nèi)金[7]。王義權(quán)等在蛇類藥材的cytb基因片斷序列分析基礎(chǔ)上，設(shè)計了金錢白花蛇PCR鑒別的一對高特異性引物BuL-Ⅰ和BuH-Ⅰ，用此引物能在藥材粉末中檢測出被檢樣品中是否含有金錢白花蛇[8]。Hashimoto等[9]用PCR方法擴增了鹿茸、蝮蛇和海馬的12SrRNA和cytb基因片斷，并對鹿茸的PCR產(chǎn)物進行了測序，經(jīng)電泳檢測可達到鑒別的目的，同時還建立了制劑中鹿茸的檢測方法。中藥材真?zhèn)舞b別及品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用最多的一個領(lǐng)域。目前藥材市場上還大量存在不同替代品混用的現(xiàn)象，不同地區(qū)同名異物入藥，或是緊俏藥材使用其近緣植物入藥，甚至使用其它偽品假冒名貴藥材。盡管藥材在干燥過程中DNA有所降解，但干品仍然帶有足夠多的DNA信息特別是穩(wěn)定的小分子帶，可供鑒別藥材使用[10]，因此，不論新鮮藥材還是干品飲片，或是不同藥用部位，通過DNA指紋圖譜技術(shù)皆能準確予以鑒別。近年來這方面的研究較多，如人參、西洋參的鑒別[11]，西洋參及其偽品的鑒別[12]，人參不同栽培品種鑒定[一三]，山參、園參與西洋參指紋圖鑒別[14]，厚樸及其偽品的鑒別[一五]，大黃正偽品的鑒別[16]，不同產(chǎn)地牛蒡子DNA指紋圖譜鑒別[17]，金銀花品種鑒定[一八]。中藥材的質(zhì)量除了與藥材特定的生長環(huán)境和特殊的采收加工技術(shù)有關(guān)外，還與該藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關(guān)，這就是藥材的“道地性”。但以前對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學(xué)、藥理學(xué)方面。通過DNA分子手段和化學(xué)、藥理學(xué)手段結(jié)合對道地藥材進行研究，并進一步對遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關(guān)系進行研究，能更好地對道地藥材、名優(yōu)藥材進行品質(zhì)評價，這對指導(dǎo)道地藥材的科學(xué)栽培、飼養(yǎng)和藥用優(yōu)良品種的選育具有重要意義。李萍等［19］用SDS法提取金銀花（FlosLonicerajaponica）不同居群、外類群細氈毛忍冬（L．simitis）和山銀花（L．confusa）的總DNA，進行5S-rRNA基因間區(qū)的PCR擴增和測序，并用軟件Mega進行分析。結(jié)果顯示，LoniceraL．屬植物5S-rRNA基因間區(qū)約210bp，其中G+C含量較高，達70%左右；不同居群的L.japonica堿基序列有差別，通過測序可以進行鑒別。L．confusa與L．japonica間的遺傳距離較大。種間5S-rRNA基因間區(qū)的序列差異大于種內(nèi)；道地藥材之間的遺傳距離較小；道地與非道地藥材之間的遺傳距離大于道地藥材之間的遺傳距離。可見通過對道地藥材DNA指紋的認定，還可提供劃分藥材檔次的分子標(biāo)記。三、結(jié)語餃化學(xué)奔指紋層圖譜娛反映眨中藥凝的質(zhì)谷量優(yōu)討劣感，而守生物繼指紋棒圖譜拔反映背中藥艘的品址種真騙偽。纖從中磨藥的腿遺傳看物質(zhì)舟到化岔學(xué)渾活性際成分凳的系性列研澆究，揭以生襯物遺們傳數(shù)蘆據(jù)庫束、化撿學(xué)成卷分數(shù)搜據(jù)庫評為基趁礎(chǔ)，昆運用雜數(shù)學(xué)綠方法令建立奔多元調(diào)統(tǒng)計飽模型毅，可緣體現(xiàn)合出中勒藥生積物信靜息與原化學(xué)些信息不的復(fù)煩雜關(guān)榜聯(lián)，圣創(chuàng)立顧全新赴的中童藥鑒剛別和屯質(zhì)量她評價運體系蒜。答從中獲藥新津藥研拋究出隨發(fā)，拍可在惑開始府研究侵階段掘，即雄同時番進行糾化學(xué)沸成分鏟指紋鍋圖譜佳和固生物堂指紋塘圖譜饑的研誠究，涉一舉舞達到醫(yī)建立頌同時削體現(xiàn)紹化學(xué)皂和分案子生除物指滾紋圖費譜。榮這兵樣，瘦中藥鎖新藥葉開發(fā)榨研究則乃至諷整個鑒中醫(yī)啊藥理莊論將盲會增搞添更諸多的嫌方法禍和內(nèi)乓容，裙實現(xiàn)怎中醫(yī)泉藥理老論質(zhì)輩的飛右躍。捎參考構(gòu)文獻備[蔽1許]詢王志蘭平弟,維喬建哨軍可,股元英女進督.歲蛋白兼質(zhì)組碌學(xué)在傷中藥樓現(xiàn)代出化研象究中板的應(yīng)隔用抗[蠢J]蛇.壘某中草柜藥揪,污20姜04顯,倘3水5春(1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