關(guān)于中藥生物指紋圖譜的調(diào)研報(bào)告

中藥生物指紋圖譜調(diào)研報(bào)告一、中藥生物指紋圖譜簡(jiǎn)介中藥生物指紋圖譜（biologicalfingerprintofTCM）是利用基因組學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)研究藥材基因型特征和中藥作用于特定生物細(xì)胞后引起基因和蛋白的表達(dá)的變化規(guī)律和作用機(jī)制，從分子水平上揭示中藥、中藥與生物的細(xì)胞作用后的基因與蛋白的表達(dá)特征，研究解決化學(xué)成分和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性，是中藥指紋圖譜研究的一個(gè)重要方面和最高級(jí)階段。主要包括中藥基因組學(xué)指紋圖譜、中藥蛋白組學(xué)指紋圖譜和中藥材DNA指紋圖譜[1]。目前，由于宏觀上中藥作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制的多樣性及對(duì)基因作用的多樣性，中藥基因組學(xué)指紋圖譜和蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜可反映中藥制劑作用于某特定細(xì)胞或動(dòng)物后所引起的基因或蛋白的特定構(gòu)象的復(fù)雜變化情況。這兩種指紋圖譜可稱為生物活性指紋圖譜。這種指紋圖譜不但包含了化學(xué)信息，也體現(xiàn)了和此相關(guān)的藥效、臨床療效等生物醫(yī)藥信息，通過(guò)比較不同蛋白質(zhì)、基因指紋圖譜體現(xiàn)的不同藥效結(jié)果，就可確定何種物質(zhì)基礎(chǔ)(化學(xué)成分群)是該中藥制劑的最佳方式，而且為解決中藥研究中缺乏標(biāo)準(zhǔn)品的難題提供了一條可行之路[1]。目前，中藥基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)有關(guān)指紋圖譜的研究工作正在開(kāi)展。中藥蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)指紋圖譜可從分子水平上豐富整個(gè)中藥指紋圖譜研究體系。無(wú)論是中成藥二次開(kāi)發(fā)，還是中藥新藥研究，都有一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決--逐步在分子水平上研究解決化學(xué)成分(物質(zhì)基礎(chǔ))和藥理作用、藥效活性的相關(guān)性。而其中，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究得到的蛋白質(zhì)組學(xué)指紋圖譜又具有很高的說(shuō)服力。中藥材DNA指紋圖譜多運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)從不同生物樣品中人工合成DNA片段,這種DNA片段的大小、數(shù)目因不同生物而異,因而稱之為DNA指紋圖譜。由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)直接分析的是生物遺傳因子而非表現(xiàn)型,所以結(jié)果可不受環(huán)境因素、樣品狀態(tài)和材料來(lái)源等外界條件的影響,因此為中藥品種鑒別中極為可靠的手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,已有文獻(xiàn)報(bào)道用DNA指紋圖譜作為藥材的鑒定方法.李曉波[2]等人的研究預(yù)示DNA指紋技術(shù)正在逐漸成為中藥鑒定的一種新方法。DNA指紋圖譜由于其特點(diǎn)，無(wú)法客觀反映藥用植物因外部環(huán)境影響基因表達(dá)造成的藥效成分含量的差異，只能用于藥材種質(zhì)資源的考察。對(duì)于DNA指紋技術(shù)在中藥材鑒定方面的推廣和普及的關(guān)健是降低檢測(cè)成本和簡(jiǎn)化操作過(guò)程。目前，應(yīng)用于中藥質(zhì)量研究的DNA分析技術(shù)主要有分子雜交和PCR兩方面。前者有以低拷貝序列基因?yàn)閷?duì)象的RFLP(限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性),以中度重復(fù)序列為對(duì)象的衛(wèi)星DNA指紋圖，后者有RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)，AFLP(擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度多態(tài)性)和DNA測(cè)序等。二、中藥生物指紋圖譜應(yīng)用中藥譜效關(guān)系研究彌補(bǔ)了目前以化學(xué)指紋圖譜控制中藥質(zhì)量時(shí)與藥效脫鉤的不足，可為中藥質(zhì)量控制提供更為科學(xué)有效的數(shù)據(jù)。但是中藥譜效關(guān)系研究需要制備足夠量的樣品開(kāi)展藥理實(shí)驗(yàn)，因此不適于中藥復(fù)雜體系效應(yīng)成分的高通量篩選與確證。為此，高通量篩選中藥效應(yīng)成分的生物指紋圖譜技術(shù)的出現(xiàn)為中藥有效性評(píng)價(jià)提供了另一思路和方法。生物色譜法是應(yīng)用最早的生物指紋圖譜技術(shù)，包括分子生物色譜、生物膜色譜和細(xì)胞生物色譜等，其基本原理是將生物大分子或靶體甚至細(xì)胞(酶、受體、DNA、仿生物膜、細(xì)胞等)固著于色譜擔(dān)體上，作為一種生物活性填料用于液相色譜，形成一種能夠模擬藥物與生物大分子、靶體或細(xì)胞相互作用的色譜系統(tǒng)，這樣就可以利用色譜參數(shù)快速、精確、穩(wěn)定地表征藥物與生物大分子靶體或細(xì)胞間的相互作用。由于能與生物體系發(fā)生相互作用是化學(xué)成分發(fā)揮藥效的前提，因此可借此從復(fù)雜的中藥化學(xué)成分中篩選潛在的效應(yīng)成分(組)。例如，孔亮等[3]根據(jù)不同藥物與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合力的差異，應(yīng)用HSA分子生物色譜分析中藥活性成分。在相同的色譜條件下，用HSA柱分別分離了當(dāng)歸、黃芪、川芎和赤芍四種單味中藥的水提物，發(fā)現(xiàn)它們的分離情況各有特征。當(dāng)歸、黃芪譜圖中各有4個(gè)明顯的保留組分，赤芍譜圖中有2個(gè)保留組分。與HPLC相比，HSA分子生物色譜排除了大量非作用成分的干擾，同時(shí)，與HSA的相互作用可表征化學(xué)成分在體內(nèi)的分布、代謝及排泄等過(guò)程。為此，HSA分子生物色譜法可用于篩選中藥中可能的生物活性成分。目前，對(duì)中藥生物指紋圖譜的研究開(kāi)展較少，較成熟的方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）同工酶法和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)（RAPD）等方法。石俊英等［4］在國(guó)內(nèi)首先將PAGE法應(yīng)用于植物、動(dòng)物類中藥材的真?zhèn)舞b別。DNA指紋圖譜技術(shù)比傳統(tǒng)的四大鑒別方法更為準(zhǔn)確、客觀，適用范圍更廣，非常適合于近緣種、易混淆品種、珍稀品種、動(dòng)物藥材、破碎藥材、陳舊藥材、腐爛藥材及樣品量極為有限的植物模式標(biāo)本、中藥出土標(biāo)本、古化石標(biāo)本等珍貴樣品的鑒定[5]。它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種)，而且可以檢測(cè)外型極為相似的同種中不同變種、變型、品系、乃至個(gè)體之間的DNA的細(xì)微變異。這一技術(shù)近年來(lái)正越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用于中藥材鑒別，道地藥材的鑒定以及動(dòng)、植物中藥種質(zhì)資源和遺傳育種的研究中,并且取得了令人矚目的成果。Mizukami比較分析了當(dāng)歸Angelicaacutiloba(Sieb.etZucc.)Kitag.、三島柴胡Bupleurumfalcatumacut.sin.nonL.和珊瑚菜GlehnialittoralisFr.SchmidtexMiq.的5SrRNA基因的間隔區(qū)的堿基序列，針對(duì)該DNA片斷的序列差異，選用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化PCR產(chǎn)物，所獲得的圖譜可鑒別此3種藥材[6]。王建云等從雞內(nèi)金類藥材中提取DNA，采用cyt2b基因PCR特異擴(kuò)增,DNA測(cè)序得到約143個(gè)堿基的序列片斷，其中36個(gè)堿基的差異可以明確區(qū)分外觀十分相似的雞內(nèi)金與鴨內(nèi)金[7]。王義權(quán)等在蛇類藥材的cytb基因片斷序列分析基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了金錢白花蛇PCR鑒別的一對(duì)高特異性引物BuL-Ⅰ和BuH-Ⅰ，用此引物能在藥材粉末中檢測(cè)出被檢樣品中是否含有金錢白花蛇[8]。Hashimoto等[9]用PCR方法擴(kuò)增了鹿茸、蝮蛇和海馬的12SrRNA和cytb基因片斷，并對(duì)鹿茸的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，經(jīng)電泳檢測(cè)可達(dá)到鑒別的目的，同時(shí)還建立了制劑中鹿茸的檢測(cè)方法。中藥材真?zhèn)舞b別及品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用最多的一個(gè)領(lǐng)域。目前藥材市場(chǎng)上還大量存在不同替代品混用的現(xiàn)象，不同地區(qū)同名異物入藥，或是緊俏藥材使用其近緣植物入藥，甚至使用其它偽品假冒名貴藥材。盡管藥材在干燥過(guò)程中DNA有所降解，但干品仍然帶有足夠多的DNA信息特別是穩(wěn)定的小分子帶，可供鑒別藥材使用[10]，因此，不論新鮮藥材還是干品飲片，或是不同藥用部位，通過(guò)DNA指紋圖譜技術(shù)皆能準(zhǔn)確予以鑒別。近年來(lái)這方面的研究較多，如人參、西洋參的鑒別[11]，西洋參及其偽品的鑒別[12]，人參不同栽培品種鑒定[一三]，山參、園參與西洋參指紋圖鑒別[14]，厚樸及其偽品的鑒別[一五]，大黃正偽品的鑒別[16]，不同產(chǎn)地牛蒡子DNA指紋圖譜鑒別[17]，金銀花品種鑒定[一八]。中藥材的質(zhì)量除了與藥材特定的生長(zhǎng)環(huán)境和特殊的采收加工技術(shù)有關(guān)外，還與該藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關(guān)，這就是藥材的“道地性”。但以前對(duì)道地藥材“道地性”的研究?jī)H限于化學(xué)、藥理學(xué)方面。通過(guò)DNA分子手段和化學(xué)、藥理學(xué)手段結(jié)合對(duì)道地藥材進(jìn)行研究，并進(jìn)一步對(duì)遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關(guān)系進(jìn)行研究，能更好地對(duì)道地藥材、名優(yōu)藥材進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)，這對(duì)指導(dǎo)道地藥材的科學(xué)栽培、飼養(yǎng)和藥用優(yōu)良品種的選育具有重要意義。李萍等［19］用SDS法提取金銀花（FlosLonicerajaponica）不同居群、外類群細(xì)氈毛忍冬（L．simitis）和山銀花（L．confusa）的總DNA，進(jìn)行5S-rRNA基因間區(qū)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序，并用軟件Mega進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，LoniceraL．屬植物5S-rRNA基因間區(qū)約210bp，其中G+C含量較高，達(dá)70%左右；不同居群的L.japonica堿基序列有差別，通過(guò)測(cè)序可以進(jìn)行鑒別。L．confusa與L．japonica間的遺傳距離較大。種間5S-rRNA基因間區(qū)的序列差異大于種內(nèi)；道地藥材之間的遺傳距離較?。坏赖嘏c非道地藥材之間的遺傳距離大于道地藥材之間的遺傳距離?？梢?jiàn)通過(guò)對(duì)道地藥材DNA指紋的認(rèn)定，還可提供劃分藥材檔次的分子標(biāo)記。三、結(jié)語(yǔ)餃化學(xué)奔指紋層圖譜娛反映眨中藥凝的質(zhì)谷量?jī)?yōu)討劣感，而守生物繼指紋棒圖譜拔反映背中藥艘的品址種真騙偽。纖從中磨藥的腿遺傳看物質(zhì)舟到化岔學(xué)渾活性際成分凳的系性列研澆究，揭以生襯物遺們傳數(shù)蘆據(jù)庫(kù)束、化撿學(xué)成卷分?jǐn)?shù)搜據(jù)庫(kù)評(píng)為基趁礎(chǔ)，昆運(yùn)用雜數(shù)學(xué)綠方法令建立奔多元調(diào)統(tǒng)計(jì)飽模型毅，可緣體現(xiàn)合出中勒藥生積物信靜息與原化學(xué)些信息不的復(fù)煩雜關(guān)榜聯(lián)，圣創(chuàng)立顧全新赴的中童藥鑒剛別和屯質(zhì)量她評(píng)價(jià)運(yùn)體系蒜。答從中獲藥新津藥研拋究出隨發(fā)，拍可在惑開(kāi)始府研究侵階段掘，即雄同時(shí)番進(jìn)行糾化學(xué)沸成分鏟指紋鍋圖譜佳和固生物堂指紋塘圖譜饑的研誠(chéng)究，涉一舉舞達(dá)到醫(yī)建立頌同時(shí)削體現(xiàn)紹化學(xué)皂和分案子生除物指滾紋圖費(fèi)譜。榮這兵樣，瘦中藥鎖新藥葉開(kāi)發(fā)榨研究則乃至諷整個(gè)鑒中醫(yī)啊藥理莊論將盲會(huì)增搞添更諸多的嫌方法禍和內(nèi)乓容，裙實(shí)現(xiàn)怎中醫(yī)泉藥理老論質(zhì)輩的飛右躍。捎參考構(gòu)文獻(xiàn)備[蔽1許]詢王志蘭平弟,維喬建哨軍可,股元英女進(jìn)督.歲蛋白兼質(zhì)組碌學(xué)在傷中藥樓現(xiàn)代出化研象究中板的應(yīng)隔用抗[蠢J]蛇.壘某中草柜藥揪,污20姜04顯,倘3水5春(1拖)解:次1滴-曉4.屬[雪2暑]美李曉利波睡,闊壬崢兄濤亮,夾徐路歐珊丹.乞中藥株的榮DN另A暈分子似鑒別汪研究陵[扎C習(xí)]滅.鑰中國(guó)裙藥學(xué)干會(huì)學(xué)遵術(shù)年咐會(huì)論恢文集獅(奸上冊(cè)睡),帶2艙00現(xiàn)1:仿2規(guī)09買-甲11器.必[3蠢]劈Ko弊ng圾L已,恒Zo衣u店H急F,犧W慣an喇g途H奴L,翼e耕t蠟a臥.l羊C記he迅m奇ic掌a館Re鈴se足ar蕉ch獸i麗n用Ch科千in趴es棒eU負(fù)n側(cè)iv菠er揀si漁ti樂(lè)es洪(故孔亮翻,允鄒漢送法閘,債汪海湊林唱,桿等蚊.慕高等基學(xué)校償化學(xué)愈學(xué)報(bào)旬),奇秘20赴00騎,戀21崇緞(食1展):畝陣36助.秀[若4專]載石俊宗英，愿于燕侵莉，碰盧燕嘆.R歐AP禽D稍和峽PO蘇D波分析絡(luò)技術(shù)窗在金晉銀花辭品種禿鑒定捧中的竹應(yīng)用允［采J過(guò)］店.爐山東境中醫(yī)肅藥大何學(xué)學(xué)煩報(bào)，希20晴01悲，和25棋（糊2攀）：盆一三該7-描一三時(shí)8.倘[棕5賭]懸徐紅符,覺(jué)王崢君濤娘,滿胡之獵壁忠.繞中藥凝DN哪A泳分子姨鑒定危技術(shù)際的發(fā)拴展與避應(yīng)用忍[邪J委].法網(wǎng)世界穩(wěn)科學(xué)洲技術(shù)弦·絕中醫(yī)醉藥現(xiàn)漂代化索技術(shù)輩,象20敵03般(2隆)奪:賴24礦-蹤3丈1.喘[璃6刪]型Mi骨zu禾ka但mi廳H矮.瞞Am鍛p被li萌f(wàn)i凡ca吊ti監(jiān)on僑a己nd慰s這e股qu橡e房nc旦e婦of山a確5山S選rR趕NA曬ge剪ne舌s涼pa勢(shì)ce邀r葵re喜gi斷on尖f缸ro饑m英th聽(tīng)e氣cr韻ud戒e躺dr晝ug疫“A桃ng蚊el挖ic違a壤Ro耳ot催”為[形J蒼].桿B情io亞l壩Ph纖ar躺m絡(luò)Bu源ll嘴,副19母95靠,倚一八房(拜9)乳:舊1阻29存9油-束一三馬01敢.廣[佛7報(bào)]瓦王建歲云食,銷王文維,親宿兵盛,滲等耍.接DN羞A傅序列鐘分析橫技術(shù)奉鑒定普雞內(nèi)羊金的店方法欲學(xué)研旬究遠(yuǎn)[J鏟]徑.湖中國(guó)墨藥科梢大學(xué)她學(xué)報(bào)爭(zhēng),突19犬96尸,才27眼:憶47具1.笛[偷8頸]棉王義副權(quán)則,羊周開(kāi)閣亞緣,彎徐珞咸珊虹,卻等秧.中金錢銅白花疊蛇及繳其偽捧品的克cy攔tb朱基因豪序列捧分析映和暑PC絕R撥鑒別易研究躲[匪J炎].鑰目藥學(xué)代學(xué)報(bào)幣,1緒99蔑8風(fēng),玩33俊(考12熟)薄:拜94渡1唉-9載47呼.鹿[蓄9腰]密Ha棄sh習(xí)im搶ot廈o起A,亦Ni幸sh排im彈ur吵a堂N,浩K梨ok杰us區(qū)en京ya隆Y而,稈et啦a停l.改S腹tu竭di紀(jì)es尊o容n“烘Si緒gn挖al堂”c勺o(hù)n發(fā)st麗it尋ue停nt敗s榨fo拌r陽(yáng)ev俘al形ua摘ti耐on醬o求f寫an露im熱al牢c解ru掛de輸d萬(wàn)ru臂gs昨Ⅳ粘:檔ap瞇p塑li佩ca蠻ti遙on誼o銀fD致NA催a御na構(gòu)ly峰ti培ca澇l捉te來(lái)ch圈ni崇qu惹e貍to度q墻ua臉li手ty昨e浙va母l2宗ua賊ti工on尺o澆fm幸ed丹ic栽in漠es玻c擾on磁ta黃in句in沸g(shù)吐an渴im手al勾c翠ur久de鼓d趴ru千gs倉(cāng)[山J正].餓N刪at噴Me筐d,長(zhǎng)1鵝99鳴8,鵝5巾2互(1流)貨:涌38脂-賓4限6.務(wù)[1槐0]紐馬小凈軍脈,箏汪小毅全馬,睬鄒喻笛蘋襯,作等炭·者人參歸RA黃PD胡指紋忍鑒定歪的毛聞細(xì)管搖PC萍R劈方法伏〔論J痛〕晴·骨中草乘藥捐,1囑99尤8,飲29槍(3魄):潔19墊2.矛[影11腫]盜羅志殊能神,背周鋼雁,錫周肆而清殖,鋸等冠.A蔥FL絞P慌法構(gòu)央建人攜參西逐洋參禮基因?qū)医M賞DN擔(dān)A膨指紋瘋圖譜破〔輔J吳〕造.己藥學(xué)填學(xué)報(bào)錢Ac荒ta謎P辛ha院rm始ac桿er陜ti拌ca困S脂in往ic非a.濁20導(dǎo)00蟲,3娛5(渠8)徐:6掛26于.,啄[務(wù)12梳]沒(méi)王培難訓(xùn)帖,破黃豐椅,嚷周聯(lián)舌,握等番.而商品悠西洋集參捕DN技A鬼指紋燥圖譜礎(chǔ)鑒別同〔起J麻〕至.椒中藥格新藥牙與臨姥床理難,1姥99餐9,泉10亡(6居):吃36香7~沸36勇9.趁[一峽三]榆馬小皺軍拾,竿汪小靜全誰(shuí),箭肖解培根賀,奧等脖.軍人參沒(méi)農(nóng)家駕類型通AF窗LP歐指紋透研究膛〔最J配〕無(wú).筑中國(guó)坡中藥萬(wàn)雜志初,2半00更0,壽25糠(1銷2)予:7腔07賓.見(jiàn)[1犬4]頭馬小伐軍衣,鋸?fù)粜∶闳[,經(jīng)孫三猶省玩,駝等霞.茅野生皺人參侄RA況PD弦指紋擺的研譜究〔勸J劑〕喇.尋藥學(xué)器學(xué)報(bào)事,1挖99牌9,愉34筆(4框):帖31坑2~梳31膜6.佩[一堡五]尖王艇鳴,提蘇應(yīng)代娟筋,傷朱建耕明忍,茶等產(chǎn).綱中藥月材厚廈樸的唱DN較A存擴(kuò)增出產(chǎn)物格指紋遠(yuǎn)分析配研究院〔絮J龜〕后.爽中藥惡材虹,2冷00側(cè)1,革24策(1斥0)思:7地11釀.宣[1暗6]湯楊美吉華遣,扯張大盜明瞇,撇劉健郊全缺,搭等抹.笛正品功和偽嚼品大皺黃的椅RA線PD槍指紋遠(yuǎn)圖譜政鑒定痰研究蹦〔損J燕〕良.踢中草恰藥伙:2寫00秘3,