糖基轉移酶與糖苷酶課件

第二節(jié)

糖基轉移酶及其應用主要內容糖轉移酶簡介

糖基轉移酶在合成中的應用

Glycosyltransferases

應用‘activated’sugarphosphates

作為糖供體，合成glycosidiclinkage

，糖受體通常為nucleophilicgroup,usuallyanalcohol.生成的糖苷可以為O-,N-,S-,orC-glycoside

糖轉移酶簡介功能：催化糖苷鍵的合成（O-,N-,S-,orC-glycoside

）供體：活化的糖磷酸受體：親核基團（蛋白、脂、核酸、糖、小分子），通常為-OHNon-Leloirdonors：Leloirdonors：糖供體底物糖基轉移酶根據(jù)糖供體中是否含有核苷酸分為兩類。Leloir:阿根廷生物化學家，研究核苷酸代謝，1970，諾貝爾化學獎分為94家族（distinctsequence-basedfamilies）(CAZyserver,rs-mrs.fr/CAZY)

人類擁有約270多種糖基轉移酶序列，屬于33個家族。

Alpha-1,4-葡萄糖轉移酶；beta-1,4-半乳糖轉移酶；2,3-唾液酸轉移酶糖基轉移酶分類根據(jù)氨基酸序列相似性進行分類：根據(jù)蛋白結構相似性進行分類：根據(jù)糖供體和糖苷鍵連接方式進行分類：

GT-A，GT-B，其他類型Rossmann-typedomains(fornucleotidebinding)NDP-bindingdomaingenerallycontainsaconservedDXDaminoacidmotifGT-Afold:SpsAfromBacillussubtilusGT-Bfold:beta-glucosyltransferasefrombacteriophageT4LeloirGTsTransglycosylasefromStaphylococcusaureusOligosaccharyltransferaseSTT3fromPyrococcus

furiosiusNon-LeloirGTs催化機理Glycosyltransferasescatalyzethetransferofglycosylgroupstoanucleophilicacceptorwitheitherretentionorinversionofconfigurationattheanomericcentre.Thisallowstheclassificationofglycosyltransferasesaseitherretainingorinverting

enzymes.鎓

催化機理Inverting:SN2nucleophilicattackattheC1atomRetaining:doubledisplacementmechanism糖基轉移酶輔因子Many,butnotall,glycosyltransferasesutilizedivalentmetalioncofactorssuchasMn2+andMg2+.

…mainlyinglycosyltransferasesthatare

diphosphonucleoside-dependent.metalioniscoordinatedtoanoxygenofeachofthetwophosphategroups,aswellastoside-chaincarboxylatesderivedfromtheprotein..

糖基轉移酶抑制劑直接抑制糖基轉移酶活性底物類似物；過渡態(tài)類似物alpha-2,6-唾液酸轉移酶抑制劑Beta-1,4-半乳糖轉移酶抑制劑阻斷糖供體的合成N-Glycan

合成過程中，首先要合成：dolichol-pp-N-acetylglucosamineUDP-GlcANc+dolichol-p------dolichol-pp-GlcNAcN-acetylglucosamine

phosphorotransferase糖基轉移酶在合成中的應用寡糖的酶法合成具有生物活性含糖天然產物的酶法合成生物制藥----糖蛋白藥物生產策略生物制藥----糖疫苗生產策略ChemicalSynthesisofa-Gal規(guī)模小，過程復雜，立體選擇性難ReactionCatalyzedbya1,3-Galactosyltransferase碳水化合物的合成體內糖供體合成途徑

Glc,GlcNAc&ManSugar-6-pSugar-1-pSugar-NDPkinaseMutasepyrophorylase

Gal,GalNAc&FucSugar-1-pSugar-NDPkinasepyrophorylaseNeu5AcNeu5AcCMP-Neu5AcpyrophorylaseCTP

糖供體相互轉化:

GalE:UDP-Gal?UDP-Glu

GalNAcE:UDP-GalNAc?UDP-GlcNAcUGD(UDP-Glc

dehydrogenase)：UDP-Glc

?UDP-GlcAUDP-GlcA

decarboxylase:UDP-GlcA

?UDP-Xyl糖基轉移酶介導的寡糖合成PhosphorylasesGlucosyltransferasesFructosyltransferasesCyclodextrin

glucanotransferasesMany微生物中的糖供體天然糖苷化合物中的糖一般為C2,C3,C4and/orC6脫氧糖，而且大部分為6-deoxyhexosesfamily（Rhamnose）原核生物糖轉移酶具有糖供體的廣泛性6-deoxyhexoses一般通過TDP-sugars進行底物活化（TDP-Rhamnose）優(yōu)點:

區(qū)域、立體選擇性大量生產不足:

*糖基轉移酶在大量表達方面存在困難糖供體比較昂貴.

副產物抑制消除副產物抑制（堿性磷酸酶）原位產生糖供體

合成廉價的糖供體類似物.針對以上不足解決策略糖基轉移酶在工業(yè)應用中優(yōu)勢與弱點可作為LgtC底物堿性磷酸酶酶法再生糖供體策略

UDP-sugar(A)andCMP-sugar(B)糖供體的合成糖供體的合成糖供體的合成糖基轉移酶在寡糖合成中的應用（一）

具有生物活性寡糖的酶法合成Biomedicaluseofa-Galsolublea-Galantagonisttoanti-Gala-Galconjugatesinimmunotherapyagainstbacteria,virus,andcancercells.人工合成的必要性a1,3GalT催化合成a-GalEpitopes

及其衍生物HOOOHHOHOOUDPHOOOHHOHOOUDPOHOOHHOOOOHHOR1R2HOOHOOHHOHOOHOOHOHOOOOHHOR1R2UDP-Gal4-epimeraseUDPa1,3GalTR1R2OHOHOHOHNHAcbN3bSPhbOAllylabcdNHAcOHeNH2OHfUDP-Gal100mg/$416UDP-Glc5g/$529.5ECFangJ,ChenX,WangPG,etal.:J.Org.Chem.1999,64,4089-4094.通過原位再生合成a-Gal五糖FangJ,LiJ,ChenX,WangPG,etal:J.Am.Chem.Soc.1998,120,6635-6638.其他生物活性寡糖的合成（應用）InHumanmilkOOHOHOOHOOHOHOOHOHHOOOHOOOHOHOHOOHa1,4GalTlgtC

gene(a)

globotriose

Gb3OHOHOAcHNOHOOHOHOOHOOHOHOOHOHOHOOHOOHb1,3GalNAcTlgtD

gene(b)

globotetrose

Gb4OHOOHOOHOOHOHOOHOHHOOHOAcHNOH(c)

LNT-2b1,3GlcNAcTlgtA

geneOHOOHOOHOOHOHOOHOHOOHOAcHNOH(d)

LNnT:

Lacto-N-neotetraoseb1,4GalTlgtB

geneHOOHOHOOHOHOOHOOHOOHOHOOHOHOHOAcHNOHa2,3transialidase(e)

LSTDOHOAcHNHOOHHOHO2COH(WithouttheBsubunits,theAsubunithasnowayofattachingtoorenteringthecell,andthusnowaytoexertitstoxiceffect.)StxisanAB5subunittoxin.Thepentamerof(small)Bsubunitsbindingtoitsreceptorglycosphingolipid(GSL),globotriaosylceramide(Gb3)inglomerularendothelialcellmembranes,initiatesAsubunit-mediatedcelldeathleadingtoHUS（hemolyticuremicsyndrome

）,butinductionofinflammatorypathwaysisalsokey.Gb3isheterogenousinitslipidstructureandmembraneorganization,suchthatdifferentGb3formatsaredifferentiallyrecognizedbyStxfamilymembers,particularlyStx2,whichismorefrequentlyassociatedwithclinicaldisease.血型相關抗原酶法合成FluorescentlylabeledsLexconjsLex在轉移性結腸癌高表達二價腫瘤抗原酶法合成（用于檢測腫瘤位置）糖基轉移酶應用乳腺癌、前列腺癌上高表達Globo-HP-凝集素配體防治黑色素瘤寡糖的合成常常需要多種糖基轉移酶為了增加產量還有用其他一些酶分步合成費時費力？一鍋多酶法------Superbeads-------SuperbugJ.Am.Chem.Soc.1995,117,5869-5870一鍋多酶法合成透明質酸（hyaluronicacid）E1,hyaluronicacidsynthase;E2,UDP-Glc

dehydrogenase;E3,UDP-Glc

pyrophosphorylase;E4,UDP-GlcNAc

pyrophosphorylase;E5,pyruvate

kinase;E6,lactatedehydrogenase;E7,inorganicpyrophosphatase

sialylLewisX酶法大量合成E1:a1,3-fucosyltransferase；E2:pyruvate

kinase；E3:GDP-mannosepyrophosphorylaseE4:GDP-4-keto-5-deoxymannose3,5-epimerase/GDP-4-keto-6-galactosereductase；

E5:glucosedehydrogenase；E6:hexokinase；E7:phosphomannomutase；

E8:a2,3-sialyltransferase激酶歧化酶SuperbeadGalUGalTGalKPyKFRecombinantE.coli

stratins

overexpressingGalK,GalT,GalUorPykF1)Fermentation2)Lysis3)AddtoNi2+resinChenX,FangJ,WangPG,etal.:J.Am.Chem.Soc.2001,123,2081-2082.Beadswith:GalKGalTGalUPykFPeristalticpumpforcirculationReservoirwith:a1,3GalTLacOBn9.6mMATP 0.96mMPEP 19.2mMUDP 0.96mMGlc-1-P0.96mMGal 12mM

MgCl2 10mMMnCl2 10mMKCl 100mM

HEPES100mM

pH7.5LiuZ,ZhangJ,ChenX,WangPG:ChemBioChem2002,3,348-355.ProductionofUDP-GalwithSuperbeads.Superbead

用于寡糖合成aGramscalesynthesis,othersare100mgscales從多菌種發(fā)酵到

Superbug

KyowaHakko’stechnologyforlarge-scaleproductionofUDP-GalandglobotrioseutilizingmetabolicallyengineeredbacterialcellsPpa:pyrophosphataseGalU:glucose-1-phosphateuridylyltransferaseGalT:galactose-1-phosphateuridylyltransferaseGalK:galactokinaseLgtC:a1,4-galactosyltransferaseCMP-NeuAcregenerationsystembybacterialcoupling

Usingthisapproach,sugarnucleotidesincludingUDP-Gal,CMP-Neu5Ac,UDP-GlcNAcandGDP-Fuchavebeensuccessfullyproducedonalargescale.Superbugtechnologiesforthesynthesisofa-GalBacteriaNutrientsStartingMaterialsBio-synthetic

pathway

engineeringa-Gal分析合成途徑ATPADPGalK:

galactokinaseGalUT:galactose-1-phosphateuridylytransferaseGalU:

glucose-1-phosphate

uridylyltransferasePykF:

pyruvate

kinasea1,3GalT:

a1,3-galactosyltransferasea1,3GalT

Gala1,3LacLactoseUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalUTGalactosePPi克隆表達驗證相關酶Cloneandexpressindividualenzymesinthebiosyntheticpathwayofa-Gal（克隆相關酶）ConstructionanartificialbiosyntheticgeneclusterandtransferintoE.colihostcell.（構建基因簇并轉化）Largescaleproductionofa-Galoligosaccharidesusingfermentedandpermeatedcells.（發(fā)酵生產）pLDR20-aKTUFgalK+galTa1,3GalTgalUpykFT7terminatorlPRpLDR20-aKTUFAmprEcoR

VSac

IISal

IXba

ICla

I~9kblcI-repressorpMB1rbcrbcrbcrbc構建多基因表達質粒檢驗多基因表達效果66,20031,00021,50045,000LysateMIBMPure14,50097,400PykFGalKGalTGalUa1,3GalTSuperbug整個生產過程

WholeCellReactionAnalyzedbyTLC,HPLCRt,20-36h

StopbyinsertinginboilingwaterCentrifugationGelfiltrationP21HNMR,13CNMRAnalysis

CultureNM522/pLDR20-aKTUFCentrifugationOverexpressionResuspendedinTris-HClBufferE.

coli

NM522pLDR20-aKTUFa-Gal7.2gGal1.1gATP8.4gLac3.6gGlcTotalvolume:1L0.3gUDP-Glc7.2gChenX,LiuZ,ZhangW,FangJ,AndreanaP,WangPG:ChemBioChem.2002,3,47-53.大規(guī)模發(fā)酵產量Superbug-1a1,3GalTGala1,3Galb1,4GlcGalb1,4GlcUDP-GalUDPPEPPyruvateGal-1-PGlc-1-PUDP-GlcUTPPykFGalUGalKGalTGalactoseLactoseGlycolyticpathwayGlucoseATPADPGlucosePyruvatePykFPEPGlycolyticpathwayPPiNM522添加三種原料：glucose,galactose,lactosePpK:polyphosphatekinaseSuperbug-2添加三種原料：多聚磷酸,galactose,lactoseChenX,ZhangJ,KowalP,AndreanaP,WangPG:J.Am.Chem.Soc.2001,123,8866-8867.SusA:sucrosesynthaseGalE:UDP-Gal4-epimerase添加兩種原料：sucrose,lactoseSuperbug-3每次進步只有一點點，積累多了才會實現(xiàn)自己的目標。二具有生物活性的含糖天然產物及其酶法合成含糖天然產物含糖天然產物諾加霉素阿克拉霉素(安樂霉素)；蒽環(huán)類抗癌藥，它能嵌入癌細胞的DNA上，抑制核酸的合成，特別是RNA的合成，為周期非特異性藥物，在G1晚期和S晚期阻斷細胞周期。daunorubicinn.[微]道諾霉素；紅比霉素；正定霉素；柔毛霉素（用作抗腫瘤藥）含糖天然產物酶法合成Theglycosyltransferase

UrdGT2establishesbothCandO

glycosidicbonds天然抗生素竹桃霉素(landomycin)抗菌性與紅霉素類似含糖天然產物酶法合成含糖天然產物酶法合成含糖天然產物酶法合成

抗菌黃酮苷化合物

抗腫瘤黃酮苷化合物

降血脂黃酮苷化合物

研究表明，對于某些黃酮藥物，糖的存在與否會對藥效影響很大。例如：diosmin，gossipyn和rutin對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的鎮(zhèn)靜作用，但相應的苷元沒有類似作用。桔皮素（tangeratin）是一種非常有效的抗腫瘤細胞增生的藥物，體外研究表明包括桔皮素在內的三種黃酮類藥物它們的糖苷型比苷元型抗腫瘤活性更高。在對乳腺腺癌細胞抑制研究中，發(fā)現(xiàn)柚皮苷、蘆丁、芹菜素、山奈酚、白楊素的抑制活性逐漸減弱，含有糖配體的糖苷類物質活性比其他的要高些。Europeanjournalofpharmacology,2006，539(3):168-176AcomparisonofthestructuresamongthesecompoundsindicatesthefollowingelementsareessentialtothepotentialacceptorsofUGT78D1:1)the3-hydroxylgroup,2)thedoublebondintheringC,3)the4′-hydroxylgroup.Guangxiang

Ren,LianwenZhang,GlycoconjJ(2012)29:425–432酶（UGT78D1）的底物選擇性阿糖胞苷，急性白血病，糖基部分在抑制核酸代謝物與酶的結合反應中起重要作用，從而增強了其抗腫瘤效應。烯二炔類抗腫瘤抗生素通過糖基部分與DNA結合，使藥物分子嵌入DNA雙螺旋的小溝中(特別是TCCT位點)。蒽環(huán)類抗生素，環(huán)A和氨基糖部分在決定藥物與DNA的選擇性結合中起關鍵作用。該類藥物與DNA作用形成復合物的穩(wěn)定性主要決定于藥物的糖環(huán)與DNA之間的作用。以DNA為靶點的抗腫瘤藥物糖配基具有協(xié)助藥物生物轉運和特異性識別并結合DNA的作用。含糖天然產物或藥物大量存在糖分子在藥物分子執(zhí)行其功能時有時具有重要作用人工添加糖分子存在一定困難選擇合適的藥物分子或改造某種功能已知的糖苷藥物，設計合成途徑小結如下：三：糖蛋白藥物正在開發(fā)的蛋白質和抗體藥物中大約83%是糖蛋白。

2000-2005(%)2005-2010(%)抗體 35 25蛋白 15 12SmallMolecules 8 8糖蛋白市場發(fā)展速度RevenueInBillions200020052010預期發(fā)展速度預計到2010年，糖蛋白藥品市場可達680億美元。國際生物藥品市場占有率分析

蛋白糖基化的作用ProteinfoldingProteintargeting/traffickingLigandrecognition/bindingBiologicalactivityStabilityRegulatesproteinhalf-lifeImmunogenicityglycocomponent

ofglycoproteins美國Amgen公司的EPOGEN（EPO,紅細胞生成素）和Aranesp（最新的紅細胞生成素）：EPOGEN，包含有165個氨基酸，其序列與天然的內源性紅細胞生成素相同，具有相等的生物活性。Aranesp是第二代紅細胞生成蛋白，比EPOGEN多兩條N-糖鏈，包含了更多的唾液酸，其體內半衰期比EPOGEN長3倍多，從而顯示出更強的生物活性。目前糖蛋白表達的缺點和不足非人源化的糖蛋白：糖蛋白的快速清除，改變藥代動力學性質，補體激活，提高免疫原性和用藥安全問題?，F(xiàn)有人源化的糖蛋白：生產成本高，細胞容易污染，N-糖基化不足，糖基化程度不同（同一批次和不同批次）。SethuramanN,StadheimTA.Challengesintherapeuticglycoproteinproduction.Curr

Opin

Biotechnol.2006.17(4):341-6.摻入非天然氨基酸特定化學反應引入糖基修飾細胞表達復雜糖修飾蛋白特定酶切（Endo-H）、酶連（Endo-A/M）引入均一糖鏈四：糖疫苗病原微生物耐藥性逐漸變強，需要更安全有效的防治方法多種微生物表面成分可作為疫苗Inprinciple,varioustypesofcellsurfaceepitopes,characteristic

fortheinvadingorganismorrelatedtoaberrantgrowthofcells,canbeappliedtodevelopvaccines.

糖合成技術的出現(xiàn)為糖疫苗的研究應用提供了可能Theprogressinestablishingthestructureofcarbohydrateimmuno-determinantsinconjunctionwithimprovementsincarbohydratesynthesishasrendereditfeasibletodevelopnewgenerationsofcarbohydrate-basedvaccines.部分已知糖蛋白抗原糖疫苗結構Carrierprotein:KLH(keyholeLimpethemocyanin)DT(diphtheriatoxoids，CRM197))TT(tetanusToxoids)antigen

protein

Glycan(起免疫作用的只是糖鏈的一部分；oligosaccharides------有機合成或多糖降解獲得)CouplingBifunctionalspacermolecules(amino,carboxylorthiolgroups)Glycoconjugatevaccinesagainstbacterialinfections基于細菌莢膜多糖上的片段，如下列病原微生物：研究內容：糖鏈長度與疫苗功能；糖鏈數(shù)目與免疫功能Polysaccharidetype-3relateddi-,tri-andtetrasaccharride-CRM197conjugates:S.pneumoniaetype3infectionoligosaccharide/proteinratios肺炎球菌奈瑟氏腦膜炎球菌流感嗜血桿菌傷寒沙門氏菌痢疾志賀氏菌B型鏈球菌肺炎桿菌偶聯(lián)多條糖鏈更有效病原微生物糖疫苗抗寄生蟲疫苗制備更復雜.Malaria(瘧疾),toxoplasmosis（弓形體?。゛ndleishmanias（利什曼蟲）.MalariacausedbyPlasmodiumfalciparum（瘧原蟲）,靶點：對應前兩者為glycosylphosphatidylinositol

anchors(GPIs)偶聯(lián)于KLH獲得疫苗，對瘧疾有很好的防治效果。腫瘤糖疫苗至今FDA只批準了一個預防肝炎病毒的疫苗糖相關腫瘤抗原Muc-1NER-2/neuCEAP53STn

GloboH糖苷酶及其應用Glycosidehydrolases(Glycosidases)

Transglycosylases

Lyases

phosphorylases糖鏈或糖綴合物糖苷鍵天然水解時，半衰期為470萬年；糖苷酶可以提高催化效率10的17次方倍。糖苷鍵切割相關酶糖苷鍵底物及效率糖苷酶分類按水解機理：保持型&翻轉型按糖苷鍵位置：內切酶，外切酶（非還原端外切酶，還原端外切酶）包括近13萬條糖苷酶序列，分屬130個家族

(sequence-basedfamilies,rs-mrs.fr/CAZY)超過30種糖苷酶的晶體結構已經(jīng)解析Transglycosidases(transglycosylases):在寡糖和多糖之間進行糖基化反應。根據(jù)序列進行分類（EC3.2.1.-）某些保持型糖苷酶（唾液酸轉移酶），活性中心可以包含一個酪氨酸某些保持型糖苷酶的酶促反應中，有鄰基參與過程Myrosinases(芥子苷酶)Lyases(裂解酶)通過消去反應的機制（eg:a-glucan

lyases）Phosphorylase&TransglycosidasesA-R+H3PO3-----A-H2PO3+RH“磷解”糖苷鍵產物：sugar-1-P(retentionorinversion)通常為外切酶（如glycogenphosphorylase)）經(jīng)過糖苷-酶過渡態(tài)，糖的羥基親和進攻合成新的糖苷鍵“糖解”糖苷酶（環(huán)糊精合酶）TransglycosidasesPhosphorylase水解機理都要經(jīng)歷鎓離子過渡態(tài)；而且活性中心包含了兩個酸性氨基酸（一般為谷氨酸和天冬氨酸）Invertingglycosidase:AsingledisplacementmechanismRetainingglycosidase:Adoubledisplacementmechanism親和標記試劑：用于研究特定的活性位點氨基酸殘基。2-脫氧-2-氟糖；5-氟糖。機制：通過鎓離子過渡態(tài)去穩(wěn)定化實現(xiàn)。Mechanism-based,time-dependentinhibitorsofretainingglycosidehydrolases.糖苷酶研究工具Time-dependentcovalentinactivatorsofglycosidehydrolases

bicyclic

inactivatorsofglycosidehydrolasesNon-covalentglycosidehydrolaseinhibitorsNitrogen-containing‘sugar-shaped’heterocycles.Havinggreateractivitytowardsinvertingglucoside

hydrolasesratherthanretainingones(不可水解的底物類似物)（雜環(huán)糖類似物）糖苷酶在合成中的應用可逆反應為其應用于合成提供了理論基礎熱動力學控制（hydrolysisisexothermicprocess）自身轉糖基反應反應產物與反應溫度有關；