實(shí)驗(yàn)二轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變及目標(biāo)表型的篩選

實(shí)驗(yàn)二轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變及目標(biāo)表型的篩選第一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)內(nèi)容?

染色體步移法克隆已知序列的側(cè)翼序列?轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變及目的表型的篩選?大腸桿菌β-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)?利用SDS分析融合蛋白的可溶性?綠色糖單胞菌的發(fā)酵及孢外酶的提取第二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變及目的表型的篩選李麗萍第三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解細(xì)菌常見(jiàn)轉(zhuǎn)座子Tn5的結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)座機(jī)理2.學(xué)習(xí)利用轉(zhuǎn)座子進(jìn)行隨機(jī)插入突變的實(shí)驗(yàn)過(guò)程3.掌握雙親接合實(shí)驗(yàn)的原理及過(guò)程第四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座因子或跳躍因子，它可以從遺傳物質(zhì)的一部分跳躍到另一部分，從而引起遺傳變異。轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)：20世紀(jì)50年代初期，美國(guó)冷泉港實(shí)驗(yàn)室遺傳育種學(xué)家McClintock通過(guò)對(duì)玉米籽粒色斑不穩(wěn)定現(xiàn)象的研究而發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座現(xiàn)象，首次發(fā)現(xiàn)了能在基因組內(nèi)不同區(qū)域轉(zhuǎn)移的控制成分。第五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的類型：插入序列(Insertionsequence);復(fù)合轉(zhuǎn)座子(Compositetransposons);Tn5TnA轉(zhuǎn)座子家族(TnAfamily);可移動(dòng)噬菌體(Muphage).第六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理Tn5：發(fā)現(xiàn)于E.coli，序列全長(zhǎng)5818bp。核心序列：編碼三個(gè)抗生素(新霉素、博萊霉素、鏈霉素)；

兩個(gè)倒置的IS50：IS50R編碼53KD的Tnp和48KD的轉(zhuǎn)座阻遏蛋白(Inh),兩者使用同一閱讀框，但啟動(dòng)子不同。IS50L的第1442堿基處存在一個(gè)赭石突變，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7個(gè)堿基不相同，是轉(zhuǎn)座酶(Tnp)的作用位點(diǎn)。kanrstrrbleorOEIEIEOEIS50LIS50RP1(Tnp)P2(Inh)P3P4突變位點(diǎn)(Mutationsite)第七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二Tn5的轉(zhuǎn)座機(jī)理第八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二第九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理第十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理DNAsequencing第十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理非轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒：轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒：能自動(dòng)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，甚至還能

帶動(dòng)供體細(xì)胞的染色體DNA向受體細(xì)胞轉(zhuǎn)移;接合作用：質(zhì)粒在細(xì)菌間的轉(zhuǎn)移，需要供體和受體細(xì)胞間的直接

接觸才能進(jìn)行.受體菌，ApNx巴西固氮螺菌Sp7供體菌S17-1質(zhì)粒pRL1063a,Km重組巴西固氮螺菌，ApNxKm第十三頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)原理植物生長(zhǎng)激素，由植物根系細(xì)菌合成，對(duì)植物的生長(zhǎng)及一些發(fā)育階段的調(diào)控起關(guān)鍵作用細(xì)菌中IAA合成的幾種途徑A-B：吲哚乙酰胺途徑；E-F-D：吲哚丙酮酸途徑；C-D：色氨酸側(cè)鏈途徑第十四頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二第十五頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)材料菌株E.coliS17-1/pPRL1063a;巴西固氮螺菌sp72.培養(yǎng)基及試劑(1).細(xì)菌豐富培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基LD培養(yǎng)基胰蛋白胨(g)1010酵母提取物(g)55氯化鈉(g)102.5pH7.06.8固體培養(yǎng)基加入1.3%瓊脂粉，dH2O定容至1L，121℃滅菌20min第十六頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二(2).用于IAA搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基(MAZ培養(yǎng)基)第十七頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二(3).抗生素抗生素名稱貯存液配制方法氨芐青霉素(Ap)100mg/ml水溶液，-20℃25μg/ml卡那霉素(Km)100mg/ml水溶液，-20℃50μg/ml30-50μg/ml萘啶酮酸(Nx)20mg/ml水溶液，-20℃5μg/mlE.coli

A.brasilense使用濃度3.主要儀器

小型離心機(jī)第十八頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)步驟第一天：中午12：30～13：30接種sp7至5mlLD液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)約20小時(shí)。晚5：30，接種供體菌pRL1063a/E.coilS17-1至5mlLB+Km液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)約16小時(shí)。第二天：上午9：00，用同一個(gè)1.5ml離心管收集適量供體菌和受體菌。12000rpm離心30sec，棄上清，用移液器將菌泥懸浮混勻后移入LD平板中央，盡量減少氣泡的產(chǎn)生。30℃正置培養(yǎng)過(guò)夜。注意：事先準(zhǔn)備好LD平板

第十九頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二第三天：用液體LD培養(yǎng)基洗下菌泥，鋪于同時(shí)含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30℃培養(yǎng)，篩選接合子。第四天：挑取接合子在含有上述三種抗生素的LD培養(yǎng)基平板上劃線分離，保證得到的為單菌落。第五天：挑單菌落分別接種于5mlMAZ培養(yǎng)基中30℃搖瓶培養(yǎng)（野生菌對(duì)照）.第二十頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二第六天：用比色法測(cè)定菌液中的IAA含量。比色試劑：含12g/LFeCl3

的H2SO4注意安全取1ml測(cè)量OD600；取1ml菌液12000rpm離心5min后取上清與比色試劑等量混合，搖勻后在暗處放置30min，然后測(cè)OD540nm注：空白對(duì)照，未接菌的培養(yǎng)基與比色用試劑的混合液。第二十一頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二標(biāo)準(zhǔn)曲線第二十二頁(yè)，共二十四頁(yè)，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)結(jié)果菌株(Strains)

(OD600)(OD5