實(shí)驗(yàn)四離心技術(shù)及物質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)四離心技術(shù)及物質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二離心技術(shù)概念：根據(jù)物質(zhì)沉降系數(shù)、質(zhì)量、浮力因素等的不同，應(yīng)用離心力使物質(zhì)分離、濃縮、提純的方法。應(yīng)用：分離、提純、鑒別生物高分子；分離線粒體、染色體、微粒體、溶酶體等亞細(xì)胞物質(zhì)。第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二基本原理

F：粒子在離心場中所受的離心力

a：粒子旋轉(zhuǎn)的加速度

m：沉降粒子的有效質(zhì)量

ω：粒子旋轉(zhuǎn)的角速度

r：粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)，離心力F=第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

RCF(relative

centrifugal

force)：相對離心力

rpm(revolutionsperminute)

：每分鐘轉(zhuǎn)速

低速離心時常以轉(zhuǎn)速“rpm”來表示

高速離心時則以“g”表示

相對離心力

離心力相對于重力的倍數(shù)，單位是g第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二沉降系數(shù)（S）:超速離心時，顆粒在離心場中的沉降速度用沉降系數(shù)來表示，即物質(zhì)在單位離心力場下的沉降速度。單位：Svedberg，1S=10-13s是是物質(zhì)特有的物理常數(shù)，可間接反應(yīng)分子量的大小。離心分離技術(shù)的基本理論數(shù)據(jù)，與物質(zhì)的大小、形狀、密度及介質(zhì)的密度、粘度都有關(guān)，通過對離心力和離心介質(zhì)的選擇，即可分離純化出不同質(zhì)量大小和物理形狀的物質(zhì)。

第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二另外，對某些生物高分子或亞細(xì)胞器組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子量尚不了解時，可用沉降系數(shù)對其物理特性進(jìn)行初步描述，將其區(qū)別開來，如原核生物的核蛋白體RNA（rRNA）分為5S、16S、23S，即是根據(jù)其在離心場中的行為來進(jìn)行分類。第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

離心機(jī)的類型和主要構(gòu)造

類型

工業(yè)用離心機(jī)離心機(jī)制備性離心機(jī)

實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)分析性離心機(jī)

普通離心機(jī)：<6000rpm

高速離心機(jī)：6000～20000rpm

超速離心機(jī)：≥20000rpm制備性離心機(jī)第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二主要構(gòu)造

轉(zhuǎn)頭，離心管和管帽，制冷系統(tǒng)，真空系統(tǒng)，制動裝置，指示表盤第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二轉(zhuǎn)頭

1．角式轉(zhuǎn)頭

第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

2．蕩平式轉(zhuǎn)頭：這種轉(zhuǎn)頭是由吊著的4或6個自由活動的吊桶(離心套管)構(gòu)成。

3．區(qū)帶轉(zhuǎn)頭：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭無離心管，主要由一個轉(zhuǎn)子桶和可旋開的頂蓋組成。

4．垂直轉(zhuǎn)頭：其離心管是垂直放置的。

5．連續(xù)流動轉(zhuǎn)頭：轉(zhuǎn)頭與區(qū)帶轉(zhuǎn)頭類似，由轉(zhuǎn)子桶和有入口和出口的轉(zhuǎn)頭蓋及附屬裝置組成。

最大額定轉(zhuǎn)速——一定的使用限度，使用一定次數(shù)或一定時間后遞減10%。

第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二離心管

不銹鋼和塑料離心管，管帽防止樣品溢出。

第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二離心操作的注意事項(xiàng)使用各種離心機(jī)時，必須事先在天平上精密地平衡離心管和其內(nèi)容物，轉(zhuǎn)頭中絕對不能裝載單數(shù)的管子，當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是部分裝載時，管子必須互相對稱地放在轉(zhuǎn)頭中，以便使負(fù)載均勻地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。

每個轉(zhuǎn)頭各有其最高允許轉(zhuǎn)速和使用累計(jì)期限，使用轉(zhuǎn)頭時要查閱說明書，不得過速使用。第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二裝載溶液時，要根據(jù)各種離心機(jī)的具體操作說明進(jìn)行，根據(jù)待離心液體的性質(zhì)及體積選用適合的離心管，有的離心管無蓋，液體不得裝得過多，以防離心時甩出，造成轉(zhuǎn)頭不平衡、生銹或被腐蝕;而制備性超速離心機(jī)的離心管，則常常要求必須將液體裝滿，以免離心時塑料離心管的上部凹陷變形。若要在低于室溫的溫度下離心時。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。離心過程中不得隨意離開第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二物質(zhì)代謝實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二十一、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定血清膽固醇測定血清甘油三酯測定實(shí)驗(yàn)二十、鄰甲苯胺法測血糖含量第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)二十一、糖酵解中間產(chǎn)物的鑒定

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

檢測糖酵解中間產(chǎn)物磷酸丙糖的生成。

【實(shí)驗(yàn)原理】第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二糖酵解的反應(yīng)過程見下圖：第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二將酵母液（含有葡萄糖及糖酵解的全部酶）在一定的介質(zhì)中（適宜的pH，必要的金屬離子等）進(jìn)行保溫，在酵母液中酶體系的作用下，酵母液中原來含有的糖就進(jìn)行酵解反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到生成二分子磷酸丙糖，進(jìn)一步變化是在3－磷酸甘油醛脫氫酶催化下進(jìn)行的，－SH為3－磷酸甘油醛脫氫酶的必需基團(tuán)，加入一碘醋酸可與此酶的－SH起反應(yīng)，從而使酶失去活性，酵解反應(yīng)就停留在磷酸丙糖階段。酶-SH+ICH2COOH→酶S-CH2COOH+HI第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二然后以硫酸肼為穩(wěn)定劑，保護(hù)磷酸丙糖不致自發(fā)分解，使其不能向其他方向變化，結(jié)果磷酸丙糖在反應(yīng)體系中堆積，從而與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成相應(yīng)的苯腙，后者在堿性溶液中溶解呈紫紅色，可借此鑒定丙糖之生成。第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二【實(shí)驗(yàn)方法】取試管3支，編號，按下表進(jìn)行操作．記錄三管所發(fā)生的情況，并加以簡要的分析．CCL3COOH的作用：強(qiáng)酸，使糖酵解的全部酶失活。一碘醋酸的作用：使3－磷酸甘油醛脫氫酶失活。硫酸肼的作用：穩(wěn)定磷酸丙糖，使其不向其它方向轉(zhuǎn)變。第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二試劑（ml）123pH7.4磷酸鹽緩沖液一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH酵母液水2.0

0.5

0.51.04.0－2.00.50.5－4.01.02.0－－－4.02.0混勻，在37℃－38℃恒溫水浴中保溫30分鐘一碘醋酸硫酸肼10％CCL3COOH

水－－－2.0

－－1.01.0

0.50.51.0－混勻，靜置10分鐘，離心,3000轉(zhuǎn)/min,10分鐘，再取三支試管，對號按下表操作上清液1mol/LNaOH

0.50.50.5

0.50.50.5混勻，在室溫放置10分鐘2，4－二硝基苯肼1mol/LNaOH0.53.50.53.50.53.5第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：成腙反應(yīng)前，溶液必須先堿化并在室溫放置10min，目的是使磷酸丙糖中的磷酸基水解脫去，生成的顏色比較穩(wěn)定；一碘醋酸和三氯乙酸是酶的抑制劑，使用移液管后必須徹底清洗移液管，否則易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二血清膽固醇測定（酶法）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1.了解膽固醇氧化酶法測定血清膽固醇的原理。

2.掌握血清膽固醇測定的臨床意義。第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

血清中總膽固醇包括膽固醇酯(CE,70%)和游離型膽固醇(FC,30%)。膽固醇酯酶（CEH）先將膽固醇酯水解為膽固醇和游離脂肪酸（FFA），膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）的作用下氧化生成Δ-4--膽甾烯酮和過氧化氫。后者經(jīng)過氧化物酶（POD）催化與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，生成紅色的醌亞胺，其顏色深淺與膽固醇的含量呈正比，在500nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計(jì)算出血清膽固醇的含量。反應(yīng)式如下：【實(shí)驗(yàn)原理】第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二1.標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用肝素鈉、EDTA抗凝，不可用草酸鹽、氟化物。2.取試管3支，編號，按下表操作?！緦?shí)驗(yàn)方法】加入物（ul）測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清10--膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液-10-蒸餾水--10酶應(yīng)用液100010001000第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二【計(jì)算】ΔA標(biāo)本

CHO（mmol/L）=——————×標(biāo)準(zhǔn)液濃度

ΔA標(biāo)準(zhǔn)

【標(biāo)準(zhǔn)液】

膽固醇5.17mmol/L（200mg/dL）

【正常參考范圍】3.10～5.70mmol/L混勻后，37℃水浴保溫15分鐘，在500nm波長處比色，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度。

第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二血清甘油三酯的測定（酶法）【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、了解酶法定量測定血清甘油三酯的基本原理。

2、掌握酶法定量測定血清甘油三酯的實(shí)驗(yàn)方法。第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二

血清中甘油三酯經(jīng)脂肪酶水解為甘油和脂肪酸，甘油在甘油激酶（GK）及ATP存在下，生成3-磷酸甘油，爾后，在磷酸甘油氧化酶（GPO）作用氧化成磷酸二羥丙酮并生成過氧化氫，過氧化氫與底物4-氨基安替比林和ESPAS在過氧化物酶（POD）作用下，生成紅色亞醌化合物，其顏色深淺與甘油三酯含量成正比。在500nm波長處測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)管比較可計(jì)算出血清甘油三酯的含量。反應(yīng)式如下：

甘油三酯+4H2O

脂蛋白脂酶甘油+脂肪酸甘油+ATP

甘油激酶/Mg2+

甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O2

甘油-3-磷酸氧化酶磷酸二羥丙酮+H2O22H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林過氧化物酶紅色醌亞胺色素+4H2O【實(shí)驗(yàn)原理】第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二1.標(biāo)本：不溶血的血清或血漿標(biāo)本。血漿用肝素鈉、EDTA抗凝，不可用草酸鹽、氟化物。2.取試管3支，編號，按下表操作。【實(shí)驗(yàn)方法】加入物（ul）測定管標(biāo)準(zhǔn)管空白管血清10--甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)液-10-蒸餾水--10酶應(yīng)用液100010001000第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期二【計(jì)算】

ΔA標(biāo)本甘油三酯（mmol/L）=——————×標(biāo)準(zhǔn)液濃度

ΔA標(biāo)準(zhǔn)【標(biāo)準(zhǔn)液】

甘油三酯2.26