堿裂解法提取質(zhì)粒-配方,最好的說明

1裂解法提取質(zhì)粒細(xì)胞器和細(xì)菌細(xì)胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來專(plasmid)。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進(jìn)細(xì)類：于質(zhì)粒的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。I2表達(dá)、純化和檢測為一體的整合系統(tǒng)。具有以下優(yōu)點(diǎn)：有一個可以用化學(xué)物質(zhì) i宿主中；一個AmpiR基因以便于陽性克隆的篩選。DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的宿主(受是所謂的感受態(tài)，即指受體(或者宿主)最易接受外源DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)3或-70℃保存(有效期6個月)。3.轉(zhuǎn)化:是將異源DNA分子引入一細(xì)胞株系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀化學(xué)的方法(熱擊法)；使用化學(xué)試劑(如CaCl)制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過熱擊：4其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結(jié)構(gòu)向micelle (微囊)結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4NNaOH，即便是有SDS也無 5A(比如限制性酶切反應(yīng))，因此如果單獨(dú)用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水會干擾電泳結(jié)果的。6超螺旋(超螺旋的圈數(shù)不同)所致。．大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(可臨用前準(zhǔn)備，也可制備多管加甘油凍存(1)從新鮮的DH5α菌株平板上挑取一個單菌落，(接種到4mlLB液體培養(yǎng)lLB(4)棄上清，加入預(yù)冷的0.1MCaCl1ml后旋起菌體(在渦旋器上振蕩)，2(5)5，000rpm離心10min后棄上清，加入預(yù)冷的0.1MCaCl100ul。2(6)溫和混勻后4℃放置24-48h備用。(1)取制備好的感受態(tài)菌體，加入質(zhì)粒5ul(可變)。s(3)取出后再冰浴5min；加入800ulLB液體培養(yǎng)基。(5)取10ul培養(yǎng)物涂布于含有抗生素的LB(由質(zhì)粒的抗性決定)，37℃倒置7夾取100ul的吸頭挑取單菌落，之后把帶有菌落的吸頭放入帶有抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)3小時，記得加抗生素)。(在冰上)(6)向每個離心管中各加入150ul溶液Ⅲ，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻。(在冰上)(7)12，000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中。in(9)吸取上清(注意不要吸到中間層)到1.5ml離心管中，加入2倍體積預(yù)注：一般在第二步離心收集完菌體后再加入1mlSTE，充分洗滌菌體，12，000rpm，離心1~2min。泳脂糖具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不同大小的核酸分子利用凝膠的分子篩效應(yīng)得以分8沸騰后拿出錐形瓶(注意不要燙住手)，用吸取50ul的EB(1：1000)加入錐形lTAE(3)待膠板放進(jìn)電泳槽后向電泳槽內(nèi)加入配好的電泳液，高度漫過膠板(4)點(diǎn)樣：拿出裁成長條的稱量紙光面向上(或一次性手套，)用10ul移液器吸取3ul的質(zhì)粒，打在稱量紙上，再用10ul移液器吸取2ul的上樣緩沖液(5)電泳：接通電源，電壓設(shè)定在80v(可變)，開始電泳。(6)凝膠系統(tǒng)成相：等到指示劑快跑到膠板前沿時關(guān)閉電源，拿出膠板，通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。瓊脂脂糖的濃度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍瓊脂糖濃度/%0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1實(shí)驗(yàn)指南)9(1)使用了過多的細(xì)菌，導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：將細(xì)菌用(2)細(xì)菌懸浮不充分,存留小菌塊,導(dǎo)致菌體未被有效裂解。解決方法：注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉(5)SolutionII長時間暴露于空氣中被CO2中和，導(dǎo)致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用經(jīng)典堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA方法中的II液替代SolutionI使I用。(1)未在SolutionI中事先加入RNaseA1。解決方法：補(bǔ)加RNaseA1。(2)加入RNaseA1的SolutionI長期保存于室溫，導(dǎo)致RNaseA1活性RNaseARNA將細(xì)菌用量減半(2)宿主菌富含核酸內(nèi)切酶。解決方法：增加一步RinseA洗滌步驟以(4)培養(yǎng)的細(xì)菌被雜菌污染。解決方法：重新挑取單菌落培養(yǎng)細(xì)菌。(2