高效液相色譜方法及應(yīng)用

摘要高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)也叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatograph)等。使用高效液相色譜時(shí)，液體待檢測(cè)物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動(dòng)，由于被測(cè)物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，通過檢測(cè)器得到不同的峰信號(hào)，最后通過分析比對(duì)這些信號(hào)來判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點(diǎn)是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測(cè)器和高效微粒固定相，適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物。本文著重以分析賴氨酸銅為例介紹高效液相色譜方法及應(yīng)用。關(guān)鍵詞：高效液相色譜法的發(fā)展歷史；特點(diǎn)及應(yīng)用；賴氨酸螯合銅一、高效液相色譜法的發(fā)展歷史[1]1960年代，由于氣相色譜對(duì)高沸點(diǎn)有機(jī)物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺(tái)高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時(shí)代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個(gè)小時(shí)甚至幾十分鐘內(nèi)完成。1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實(shí)踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此后的時(shí)間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測(cè)手段，在有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測(cè)、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時(shí)還極大的刺激了固定相材料、檢測(cè)技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。1960年代前，使用的填充粒大于100um，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸?？瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實(shí)現(xiàn)了高速傳質(zhì)，為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實(shí)現(xiàn)。1960年代研制出氣動(dòng)放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵，但后者的脈沖信號(hào)很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復(fù)式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7um，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點(diǎn)。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到改變流動(dòng)相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。二、高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)又叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatography)等。高效液相色譜的特點(diǎn)⑵高壓 壓力可達(dá)150?300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。高速 流速為0.1?10.0mL/min。高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/m，在一根柱中同時(shí)分離成份可達(dá)100種。高靈敏度一一紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá)0.01ng，同時(shí)消耗樣品少。HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)⑶速度快一一通常分析一個(gè)樣品在15?30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高一一可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。靈敏度高一一紫外檢測(cè)器可達(dá)0.01mg，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá)0.1ugo色譜柱可反復(fù)使用一一用一根色譜柱可分離不同的化合物。樣品量少，容易回收一一樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。高效液相色譜儀的應(yīng)用高效液相色譜法適于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成的和天然的高分子化合物等[4]食品是人類生活中不可缺少的必需品，是人類生命活動(dòng)能量的來源。食品種類繁多，各種食品具有不同的特性和營(yíng)養(yǎng)成分，它所包含的糖、有機(jī)酸、維生素、氨基酸等直接關(guān)系到人體的健康。在食品生產(chǎn)過程中，往往需要添加防腐劑、抗氧化劑、人工合成色素、甜味劑、保險(xiǎn)劑等化學(xué)物質(zhì)，它們的含量過高就會(huì)危害人體健康。此外由于環(huán)境污染，也會(huì)使食品沾染有害的微量元素、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留等。因此，.食品分析的重要性日益受到人們的關(guān)注。近年來高效液相色譜析法在食品分析中的應(yīng)用日益增多，它比化學(xué)分析法操作簡(jiǎn)便、快速，并能提更多的有用信息。高效液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發(fā)性的限制，流動(dòng)相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性的、離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質(zhì)。與試樣預(yù)處理技術(shù)相配合,HPLC所達(dá)到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時(shí)測(cè)定性質(zhì)上十分相近的物質(zhì)成為可能，能夠分離復(fù)雜相體中的微量成分。隨著固定相的發(fā)展，有可能在充分保持生化物質(zhì)活性的條件下完成其分離。HPLC法成為解決生化分析問題最有前途的方法。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復(fù)利用，流出組分易收集等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機(jī)分析等各種領(lǐng)域。高效液相色譜儀與結(jié)構(gòu)儀器的聯(lián)用是一個(gè)重要的發(fā)展方向丘。液相色譜-質(zhì)譜連用技術(shù)受到普遍重視，如分析氨基甲酸酯農(nóng)藥和多核芳烴等；液相色譜-紅外光譜連用也發(fā)展很快，如在環(huán)境污染分析測(cè)定水中的烴類，海水中的不揮發(fā)烴類，使環(huán)境污染分析得到新的發(fā)展。三、賴氨酸螯合銅（CopperLysine）（一） 藥物簡(jiǎn)介賴氨酸是生命體必需而又無法自身合成的限制性氨基酸，在人體和動(dòng)物中有重要作用。銅是人和動(dòng)物必需的微量元素，賴氨酸螯合銅是由賴氨酸和銅離子發(fā)生反應(yīng)形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不受PH值、無機(jī)離子、有機(jī)大分子的拮抗影響，不破壞維生素，賴氨酸螯合銅具有吸收快利用率高等優(yōu)點(diǎn)，還具有雙重營(yíng)養(yǎng)性和治療作用，同時(shí)也克服了在飼料中添加過多無機(jī)鹽產(chǎn)品造成的礦物質(zhì)中毒及食用過量，減輕剩余排泄物對(duì)環(huán)境的影響，符合環(huán)保要求6］。（二） 性狀賴氨酸銅為藍(lán)色粉末，穩(wěn)定性好，易溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)為227.3?227.5°C。分子式：C12H26N4O4Cu，分子量：355.5。加入飼料中不會(huì)破壞各種不同類型的維生素，也不會(huì)催化飼料中油脂的氧化反應(yīng)。（三）藥理作用特點(diǎn)L-賴氨酸為堿性必需氨基酸，由于谷物食品中的賴氨酸含量甚低，且在加工過程中易被破壞而缺乏，故被稱為第一限制性氨基酸［7］。它是合成核蛋白、血紅蛋白及促進(jìn)大腦神經(jīng)細(xì)胞再生的重要氨基酸。L-賴氨酸對(duì)營(yíng)養(yǎng)不良，乙型肝炎，支氣管炎等有一定的輔助療效，賴氨酸與亞鐵化合物一起，治療貧血效果顯著⑻。銅是動(dòng)物體的必需微量元素之一，是多種酶和胰島素的組成部分，不僅參與和影響體內(nèi)的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類和維生素的代謝過程，而且與胰島素、促腎上腺素等激素的分泌活動(dòng)有關(guān)，被稱為“人體的衛(wèi)士”［9-10］。微量元素氨基酸螯合物化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物學(xué)效價(jià)高，能增強(qiáng)免疫力、提高抗病能力，并具有使用量少、不良作用少及環(huán)保等特點(diǎn)［11］。參考文獻(xiàn)斯奈德LR，柯克蘭JJ著，高潮等譯.現(xiàn)代液相色譜導(dǎo)論.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1988,1-15.于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用[M].第二版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005年：1-11.王俊德，商振華，郁蘊(yùn)璐編著，高效液相色譜法.北京：中國(guó)石化出版社.1992,1-9.BidlingmeyerBA.PracticalHPLCMethodologyandApplications.NewYork:Johnwiley&Sons,Inc.1992,1-26,102.辛丹敏.高效液相色譜與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用.2009,第一部分，1-4.鄭學(xué)斌，張石蕊.量元素氨基酸螯合物[J].中國(guó)飼料,2003(7):23-24.周俊,宋代軍.賴氨酸營(yíng)養(yǎng)研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè),2006,27(8):48-50.張瑞華.賴氨酸