大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因

大腸桿菌耐藥株的體外誘導(dǎo)及其acrA和marA基因分析張海旺1鄧旭明2*張煜1蘇杰1胡仲明3（1.河北北方學(xué)院，河北張家口，075131；2.中國人民解放軍軍需大學(xué)，吉林長春；130062；3.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春；130062）摘要：目的檢測大腸桿菌在某些抗菌素的環(huán)境壓力下耐藥性的變化及其與acrA和marA基因突變的關(guān)系。方法分別用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星對大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，測定誘導(dǎo)前后多種抗菌藥的MIC的變化；對各菌株的acrA和marA基因進(jìn)行克隆和測序。結(jié)果四環(huán)素誘導(dǎo)株產(chǎn)生多重耐藥，氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)引起單藥耐藥；四環(huán)素誘導(dǎo)株、氯霉素誘導(dǎo)株和環(huán)丙沙星誘導(dǎo)株的acrA和marA基因序列均與ATCC25922的一致。結(jié)論四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)培養(yǎng)并未引起ATCC25922的acrA和marA基因的突變，誘導(dǎo)引起的大腸桿菌耐藥性變化是由于其acrA和marA基因突變以外的其他原因所致。關(guān)鍵詞：大腸桿菌多重耐藥外輸泵acrAmarA由于抗菌藥物的廣泛、持續(xù)和不當(dāng)使用，各種病原菌對抗菌藥物的耐藥性日趨嚴(yán)重?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞膜上的外輸泵（effluxpump）的表達(dá)水平提高，能主動將擴(kuò)散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其他底物泵出菌體外，從而使細(xì)菌獲得非特異性的耐藥性。大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，是發(fā)現(xiàn)外輸泵最多的細(xì)菌，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了約30種外輸泵。一般認(rèn)為AcrAB－TolC是大腸桿菌主要的外輸泵[1]。它包括藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運子AcrB、周質(zhì)融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[2]。MarA是一個正調(diào)控蛋白，可增強acrAB和tolC的表達(dá)。本實驗用四環(huán)素、氯霉素和環(huán)丙沙星通過人工體外誘導(dǎo)大腸桿菌使之產(chǎn)生耐藥性，對AcrA和MarA的基因acrA和marA進(jìn)行測序分析，檢測耐藥性產(chǎn)生與acrA和marA突變的關(guān)系。1材料和方法1.1材料菌株：大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922，購自吉林省衛(wèi)生監(jiān)督檢測中心。抗菌藥：頭孢噻肟、青霉素鉀等，均為標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，中國藥品生物制品檢定所出品；鹽酸環(huán)丙沙星，對照品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所出品。染色試劑：結(jié)晶紫酒精飽和溶液、草酸銨溶液、革蘭氏碘溶液、石碳酸復(fù)紅溶液等按《藥品微生物學(xué)檢驗手冊》[3]進(jìn)行配制。載體與質(zhì)粒：克隆載體為pGEM－T，Promega公司產(chǎn)品。酶與試劑：T4DNA連接酶、ExTaqTMDNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、溶菌酶、蛋白酶K均為TaKaRa公司產(chǎn)品。其他試劑：乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）、焦碳酸二乙酯（DEPC），Sigma公司產(chǎn)品；dNTP、5－溴－4－氯－3－吲哚半乳糖苷（X－gal）、異丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖、羥基甲基氨基甲烷（Tris）等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；飽和酚、氯仿、異丙醇、CaCl2、葡萄糖、甲基紅等，均為國產(chǎn)分析純試劑；清DN痕A片大段凝來膠回劣收試團(tuán)劑盒踏（A邁ga過ro廢se裳G喬el墨D需NA鳴Pu捎ri簽fi殺ca不ti寨on丟K參it窗V水er李.2問.0哄），盼Ta摟Ka你Ra遵公司趨產(chǎn)品嚷；怖國家拾自然感基金瞧資助盞項目汗，N打o午30薄27巾09聰99鋒作者岸介紹勝：崇張海瓜旺腐，生敞于1膚9街56再年，憶博士遮，教約授。探研究禮方向互：耐蹲藥機升理。招*通彎訊作皺者厭E-趕ma粥il窗：巾zh稈w5巡14幣8壩@y懶ah彎oo駛.c買om頂..水cn蜂分子檢量標(biāo)翼準(zhǔn)參梯照物抱：D戒NA杰M臣ar摔ke春r怖DL燙2,夜00肆0要、侮λ籍－漿Hi貌nd舍薦Ⅲ饞d寬ig鳳es除t遮DN輕A場Ma似rk譜er版，均首為稼Ta專Ka任Ra膠公司養(yǎng)產(chǎn)品熄。猾引物駐：根兼據(jù)G賣en蒙Ba體nk慕中貌ac眉rA錄、穿ma伍rA悲基因羊序列甲設(shè)計火PC蠅R擴(kuò)繭增引餓物：微ac槍rA員的上補游引堂物（縫PA她CR刪－閱F）賽序列鑒為5樣′置－艇AT嗽G艷AA珠C填A(yù)A晌A天AA弟C護(hù)AG甚A舅GG屑G姻TT靈T菌AC飼G叨CC披T肆－臂3隔′克；下森游引昏物（蠢PA俘CR騾－矮R）冠5死′欣－掛TT令A(yù)犯AG相A哈CT熱T舟GG命A期CT擋G品TT動C寺AG疼G證CT買G摸－央3堡′植，坦ma綱rA描的上籃游引床物（淺PM貞AR減－求F）依序列耍為5搭′棗－載AT叛G熟AC蛋G剛AT期G撫TC雷C料AG份A劇CG腔C胖AA興T洪AC餡－庸3拖′輪，下駁游引螞物（撞PM僻AR以－搖R）鈴5估′廈－岡CT區(qū)A熔GC邊T阻GT翁T純GT爺A木AT漫G旨AT終T亞TA低A余TG條G斷－湖3舅′請。上膜海博趨亞生位物技玩術(shù)有莫限公本司合劈成。嗎儀器盡：生河物顯刑微鏡瓶，新OL善YM揀PU屢S壓產(chǎn)品康；差PC霜R搏擴(kuò)增漿儀，批TC彎－晶25魯/H歲型，它杭州嶄D憑AH家E步TH膠ER液MO獵－拴MA增GN登ET扇IC懷S賄CO晉.L牌TD摔產(chǎn)品介；電蘿泳儀超，D局YY幻－疲6B被型，翠北京分市六襪一儀雖器廠胃產(chǎn)品屈；空獻(xiàn)氣浴訂振蕩珠器，畫HZ之Q獵－丸C，抽哈爾自濱市板東明宰醫(yī)療再儀器金廠生峽產(chǎn)；跑高速絹臺式鹽冷凍酒離心茄機，遼TG癥L迫－肆16魚M看，長寺沙湘政儀離脹心機糖儀器爐有限糊公司泡生產(chǎn)蓄等。弄1.濫2.丹方泊法鋤1.岡2.癢1深菌辯株鑒摘定行對購說進(jìn)的潔菌株求作生濫化和殼形態(tài)琴鑒定汗，以跟確保虹菌株倉的可冤靠性鉆：用證營養(yǎng)輕肉湯管作復(fù)妙蘇培叉養(yǎng)，鳳再將但菌液圖接種奴于瓊區(qū)脂平培板3勿7錘o粥C培攜養(yǎng)至鵝長出看菌落慰；取燦上一硬步得建到的亡單菌野落進(jìn)翅行糖惕發(fā)酵櫻試驗繡（葡呢萄糖榨、乳慨糖、荒麥芽敏糖、槽甘露扛醇、傻蔗糖杏）、哨靛基配質(zhì)試賺驗、鳥M.副R試絕驗、次V釘—吉P試藏驗鑒魂定及滔革蘭揚氏染半色的第光鏡鮮觀察堪。鑒候定確臉認(rèn)為妄AT盛CC炸25韻92熊2的剛菌株踩作后魄續(xù)實究驗之忘用。紫1.鳥2.瞞2筒MI璃C測此定時按照狐NC藍(lán)CL亦S（云Na專ti昂on垮al鋸C辨om伍mi畫tt晝ee饑f形or璃C雞li稈ni司ca至l描La召bo溫ra喂to毅ry偶S哭ta害nd壘ar慈ds促）規(guī)朵定的沃方法藝配制義包括不誘導(dǎo)姓劑（糟氯霉研素、掛四環(huán)拋素、齒環(huán)丙拴沙星輕）在回內(nèi)的首各種殲受試碰抗菌服藥的寇標(biāo)準(zhǔn)幸溶液辜；用凳2倍跳連續(xù)嘆稀釋禿法配衫制各泛種含殺抗菌骨藥的研營養(yǎng)挨肉湯雅培養(yǎng)坡基，挖抗菌純藥的碌首選裂濃度遵范圍柴為0窄.1槳25回～火4.衛(wèi)0趨μ稈g/別ml丘培養(yǎng)匠基（巡據(jù)細(xì)未菌生辰長情到?jīng)r再把作升趣或降品的調(diào)竹整）答。在澡1m息l培們養(yǎng)基徐中接積種1適00麗μ式l菌策液（偶約為殲10宰5指CF豪U）航；3立7陡o腳C培屈養(yǎng)2屯4h溜，確勵定M化IC欣。冶1.煮2.配3勸誘導(dǎo)歲分別勻在三資種含厚1/抱2莫×纏MI互C誘憲導(dǎo)劑督的麥哨康凱窮培養(yǎng)綢基接鍵種適開量培軟養(yǎng)物威（約雜10纖5舟CF拾U）業(yè)，3畫7喉o帽C培與養(yǎng)2糟4h首，挑烏選生柿長良安好的泄菌落搜，接魯種于掠1姐×滅MI學(xué)C誘綢導(dǎo)劑隆的培競養(yǎng)基根37抬o捏C培畫養(yǎng)2便4h裹，以梳此類療推，博逐漸除提高妻培養(yǎng)智基中蔥誘導(dǎo)巨劑的游濃度蟻直到笛誘導(dǎo)蜂前M生IC杰的1眉28倘倍（鑒據(jù)細(xì)擋菌生嫩長情雁況誘梢導(dǎo)劑耽濃度局提高式幅度義可在庭1門～2趟倍于映原濃摘度的儲范圍庭適當(dāng)掩調(diào)整他，也披可當(dāng)且細(xì)菌誼生長若不良皺時在輪同一驕個濃瘋度重佛復(fù)傳猜代培訪養(yǎng)）駕。袋1.瓜2.偉4炊耐藥乞譜的巡確定疼上一未步最眠后獲溉得的壯誘導(dǎo)肝劑濃膠度達(dá)物到1已28喝×伏MI勵C的管耐藥懷株，傷作4或次無堵誘導(dǎo)注劑傳倒代培習(xí)養(yǎng)后榜，再抽分別賠測定蟻三個予誘導(dǎo)帽株對泄所有彩受試震抗菌礎(chǔ)藥的姨MI昨C，尖以確吼定三杜個誘津?qū)е昶嫉亩嗷j重耐啦藥譜慣。爽1.壯2.滋5曬受炸試菌嚇株轟ac羞rA暮、勉ma麻rA木基因駐序列愈的檢完測譯臣據(jù)上閥一步靈耐藥摘譜檢撤測結(jié)振果，既氯霉竹素誘蓬導(dǎo)株燭和環(huán)弊丙沙您星誘胖導(dǎo)株懲的耐賺藥譜休相近狂，而臺四環(huán)擦素誘摩導(dǎo)株梳的耐掘藥譜呀與之唇差異嗓較大達(dá)，故敲選擇論四環(huán)次素誘戲?qū)е晷兀鉃镾莫EM畜R）呀、環(huán)普丙沙播星誘乳導(dǎo)株燈（名權(quán)為S途EI域CI著）和置質(zhì)控塊株（爹AT奪CC用25格92逝2）窯作規(guī)ac謹(jǐn)rA抱、嫩ma依rA賢基因噸序列診的檢有測。吐1.寬2.擦5勻.皺1餓目的梁基因蠢（仿ac飽rA夜、眉ma探rA稅）的渠獲取短1.子2.沃5薄.勉1.燙1洪DN繩A提您?。厚{按盧危圣棟抖等廢[4怠]盤的方宏法提膛取S宇EM巖R、競SE扎IC刺I和辨AT朵CC蓬25夸92孤2的殿基因裂組D遼NA甘。鑄1.繞2.倚5信.1槐.2嚷亭ac桑rA淹、謎ma壤rA渾基因歉的P吳CR咱擴(kuò)增泳：以連大腸荒桿菌繭染色檔體D責(zé)NA討為?；郯?，字用引聾物搞PA朝CR兔－狹F和得PA濁CR構(gòu)－束R擴(kuò)填增穴ac棋rA自（全納長1熔19寄4b鼓p）洞，用躺PM愁A(yù)R傻－般F和提PM側(cè)AR太－忽R擴(kuò)疲增薄ma掛rA根（全種長3墻90雨bp植）。剩取5蜓μl惕PC佳R運產(chǎn)物啄在0離.7辭%仰瓊脂瞇糖凝值膠進(jìn)脈行電喂泳觀嗓察P承CR愈結(jié)果爺。齒1.杜2娛.改5念.捏1.陰3鐮PC植R暖產(chǎn)物渣的回雕收：散用D棗NA票片段榜凝膠想回收尿試劑謀盒回世收炭ac局rA腸和抓ma攤rA慢基因票的算PC截R顧產(chǎn)物準(zhǔn)，方錫法按榨試劑垮盒使包說明些書進(jìn)唐行。呀1.欄2.毀5箏.2譯ac造rA云、煩ma屢rA炸基因擁的克廣隆喪1.建2.枯5續(xù).輔2.睡1買目逼的基迫因片供段與淹載體巖的連托接：暢將回要收的礎(chǔ)PC導(dǎo)R組產(chǎn)物衫連接稻到阻pG彩EM頁－陪T疏載體虛上。犁反應(yīn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