工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生 市賽獲獎(jiǎng)

普通棉花抗蟲棉蘇云金桿菌毒蛋白蘇云金桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉要讓棉花細(xì)胞合成毒蛋白，要把蘇云金桿菌內(nèi)的什么物質(zhì)轉(zhuǎn)移到棉花細(xì)胞？為什么？共用一套密碼子毒蛋白基因（DNA）是遺傳物質(zhì)，指導(dǎo)毒蛋白的合成目的基因把蘇云金桿菌的毒蛋白基因轉(zhuǎn)移到棉花細(xì)胞，讓棉花合成毒蛋白。為什么毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)后合成的仍然是毒蛋白？轉(zhuǎn)基因技術(shù)將某種生物的基因轉(zhuǎn)移到其他生物物種中，使其出現(xiàn)原物種不具有的新性狀的技術(shù)。第一章基因工程第一節(jié)工具酶的發(fā)現(xiàn)和基因工程的誕生1.DNA分子太長(zhǎng)（所含基因多，如人的一個(gè)DNA分子中含有上千個(gè)基因），不易操作，DNA分子的直徑只有2.0nm（粗細(xì)只有頭發(fā)絲的十萬(wàn)分之一）

我們需要解決的問(wèn)題蘇云金桿菌毒蛋白抗蟲棉基因剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶運(yùn)輸工具——載體3.需要將目的基因連接到載體上基因針線——DNA連接酶2.DNA分子易被水解；保證目的基因能表達(dá)、能復(fù)制一、基因的剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶2.功能特點(diǎn)：能夠識(shí)別和切割DNA分子內(nèi)一小段特殊（脫氧）核苷酸序列的酶。3.結(jié)果：具有特異性產(chǎn)生粘性末端1.來(lái)源：在細(xì)菌等微生物內(nèi)。種類很多。切割的本質(zhì)：在特定位點(diǎn)水解磷酸二酯鍵EcoRⅠ切割DNA的實(shí)例T磷酸二酯鍵1‘2’3‘4’5‘1‘2’3’4‘5’AAATTGCCTTAAG3’3’5’5’AATTGCCTTAAGEcoRⅠ氫鍵可以自發(fā)斷裂和形成！TTAAGC3’5’GAATTCG3’5’AATTCGEcoRⅠ請(qǐng)分別說(shuō)出下列兩種限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)？特異性：識(shí)別特定序列，并在特定位點(diǎn)切割

什么叫粘性末端？被限制性核酸內(nèi)切酶切開的DNA兩條單鏈的切口，末端幾個(gè)伸出的核苷酸，稱為粘性末端。重播5’3’5’3’大腸桿菌中EcoRI限制性核酸內(nèi)切酶的作用過(guò)程限制性核酸內(nèi)切酶切一次形成幾個(gè)粘性末端？產(chǎn)生的2個(gè)粘性末端具有什么關(guān)系？?jī)蓚€(gè)粘性末端完全一樣，且相互配對(duì)思考題：若要將某個(gè)目的基因從DNA分子上剪切下來(lái)，這個(gè)DNA分子上至少含有幾個(gè)相應(yīng)限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)？水解了幾個(gè)磷酸二酯鍵？可產(chǎn)生幾個(gè)粘性末端？目的基因左右各一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)4個(gè)磷酸二酯鍵4個(gè)粘性末端限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。請(qǐng)畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后形成的粘性末端。做題方法1.補(bǔ)充識(shí)別序列為雙鏈2.根據(jù)切割位點(diǎn)畫出粘性末端①默認(rèn)序列5’→3’②兩條鏈上方的鏈5’→3’T磷酸二酯鍵1‘2’3‘4’5‘1‘2’3’4‘5’AAATTGCCTTAAG3’3’5’5’AATTGCCTTAAGEcoRⅠ氫鍵可以自發(fā)斷裂和形成！DNA連接酶用EcoRⅠ切割后的某一環(huán)狀DNA分子用EcoRⅠ切割后的目的基因用EcoRⅠ切割后的某一環(huán)狀DNA分子用EcoRⅠ切割后的目的基因二、基因的針線——DNA連接酶1、作用:將具有末端堿基互補(bǔ)的2個(gè)DNA片段連接在一起，形成重組DNA分子2、連接的部位:是DNA骨架上的缺口（也就是建立磷酸二酯鍵）DNA連接酶用EcoRⅠ切割后的某一環(huán)狀DNA分子用EcoRⅠ切割后的目的基因重組DNA分子三、基因的運(yùn)輸工具------載體1.作用：能將外源基因送入受體細(xì)胞。為什么不能將目的基因直接導(dǎo)入受體細(xì)胞完成轉(zhuǎn)化呢？2、作為載體的必要條件（特點(diǎn)）：①能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存②能使目的基因表達(dá)③對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害④⑤3、載體種類：質(zhì)粒和病毒（噬菌體、動(dòng)物病毒、植物病毒最常用的載體－－質(zhì)粒P4質(zhì)?！?xì)菌中獨(dú)立于擬核之外能自主復(fù)制的小型雙鏈環(huán)狀DNA分子；質(zhì)粒的分布：細(xì)菌、真菌等（最常用的質(zhì)粒：大腸桿菌的質(zhì)粒）作為載體的必要條件（特點(diǎn)）：④有多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)⑤具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗生素的抗性基因、具有顏色反應(yīng)的基因等）不同點(diǎn)：DNA連接酶是將DNA片段的末端連接起來(lái)，形成重組DNA。DNA聚合酶是在復(fù)制過(guò)程中將一個(gè)個(gè)游離的脫氧核苷酸連接形成子鏈上。DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同和不同點(diǎn)？相同點(diǎn)：化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)，都催化形成磷酸二酯鍵。變異類型：操作水平：意義：基因重組DNA分子水平1）基礎(chǔ)理論研究方面：在基因的結(jié)構(gòu)、功能和表達(dá)調(diào)控等方面有重要意義2）生產(chǎn)實(shí)踐方面：a.定向地改造生物的遺傳性狀，獲得人類所需要的品種。b.實(shí)現(xiàn)種間遺傳物質(zhì)的交換（克服遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙、或克服生殖隔離）構(gòu)建重組DNA分子核心：基因工程的誕生理論基礎(chǔ)技術(shù)保障P2基因工程的工具（重點(diǎn)）工具酶載體（運(yùn)載體）：重點(diǎn)掌握質(zhì)粒的含義、特性及作用限制性核酸內(nèi)切酶：含義、作用特點(diǎn)及過(guò)程DNA連接酶：作用基因工程的含義及主要內(nèi)容小結(jié)1.“DNA是遺傳物質(zhì)”的發(fā)現(xiàn)2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的確立及遺傳信息傳遞方式的認(rèn)定3.遺傳密碼的破譯

工具酶和質(zhì)粒作為載體的發(fā)現(xiàn)為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)。

世界上首次成功的DNA體外重組實(shí)驗(yàn)，第一個(gè)人工DNA重組產(chǎn)物。P3

基因工程發(fā)展史上第一個(gè)成功的基因克隆實(shí)驗(yàn)，標(biāo)志著基因工程的誕生。P3基本要求：1.說(shuō)出基因工程的含義并指出基因工程的主要內(nèi)容。2.說(shuō)出限制性核酸內(nèi)切酶的含義及作用特點(diǎn)。3.說(shuō)出DNA連接酶的作用。4.簡(jiǎn)述質(zhì)粒的含義、特性及其在基因工程中的作用。發(fā)展要求：解釋限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶和質(zhì)粒對(duì)誕生基因工程的作用說(shuō)明：對(duì)于限制性內(nèi)切酶，只要求了解教科書中提到的兩種限制性核酸內(nèi)切酶的堿基識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。單核苷酸鏈的走向不作拓展。若目的基因內(nèi)部有限制酶識(shí)別切割位點(diǎn)，該酶不作選擇。A．用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌體載體DGC

TT

AA

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C

GG

C

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TT

C

GGC

TT

AA

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TT

C

GDNA連接酶在脫氧核糖與磷酸基團(tuán)之間形成

磷酸二酯鍵氫鍵自發(fā)形成G

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GEcolⅠ切割DNA連接酶在脫氧核糖與磷酸基團(tuán)之間形成

磷酸二酯鍵氫鍵自發(fā)形成

當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。DNA連接酶分為兩類：①?gòu)拇竽c桿菌中分離得到：EcoRⅠDNA連接酶，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端之間連接。②從T4噬菌體中分離到：

T4連接酶，既可以“縫合”雙鏈DNA片段互補(bǔ)的粘性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低。注意

如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制性核酸內(nèi)切酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？小型環(huán)狀DNA兩兩結(jié)合，可能形成幾種情況？基因工程作業(yè)中的問(wèn)題：區(qū)分以下概念例如（1）具有菠菜基因的豬，體內(nèi)不飽和脂肪酸要比一般的豬高約20%，說(shuō)明：（2）菠菜基因之所以能