天然藥物化學實驗指導全文

/天然藥物化學實驗注意事項天然藥物化學試驗的特點是實驗周期長,所用溶劑和試劑品種多,而且用量較大。許多有機溶劑具有易燃、有毒、腐蝕性，刺激性和爆炸性等特點。在實驗操作過程中又經常需要加熱或減壓等操作,學生將接觸各種熱源和電器。如果操作不慎，易引起中毒、觸電、燒傷、燙傷、火災、爆炸等事故。所以要求每個實驗操作者,必須加強愛護國家財產和保障人民生命安全的責任心，嚴格遵守操作規(guī)程，樹立嚴密的科學實驗態(tài)度,提高警惕，消除隱患,預防事故的發(fā)生。為了確保實驗的安全進行，特作如下要求:一、實驗前要必須充分預習實驗內容,明確實驗原理、操作步驟及注意事項.實驗開始前應檢查儀器是否完整無損,裝置是否正確，經檢查合格后方可開始實驗。二、實驗時要保持室內整齊、清潔、安靜.不準做與實驗無關的事情，不得擅自離開崗位。在實驗過程中應密切觀察實驗進程是否正常，儀器又無漏氣,破裂等現(xiàn)象。三、倒取和存放易燃性有機溶劑時，要遠離火源。不得隨意將易燃性、易爆性的有機溶劑及藥品倒入水槽或污水缸內。不得在烤箱內烘烤留有易燃性有機溶劑的儀器或物品。四、使用精密儀器及電氣設備時，應先了解其原理及操作規(guī)程，檢查好電路,按操作規(guī)程進行.遇到不明了的問題應及時向老師請教,切忌自作主張,亂倒以儀器。電線及儀器不應放在潮濕處,不要用濕手接觸電器。電器用完后,應立即清理，關好電源。五、回流或蒸餾易燃性有機溶劑時，應檢查冷凝水是否暢通，儀器裝置是否漏氣.不得用明火直接加熱,應根據(jù)其沸點選用水浴、油浴或砂浴.蒸餾溶劑時要加入沸石，否則將發(fā)生爆沸.添加溶劑時要移開水浴，待溶劑冷卻后再加,并應重新加沸石。六、實驗室中常用的苯、鹵代苯、苯酚、苯胺、甲醇、二硫化碳、氰化物、汞和鉛鹽等化合物均為有毒或劇毒藥品。人體中毒的途徑一般為消化道、呼吸道或皮膚吸收。所以取用毒劇藥時要注意切勿灑在容器外，不要接觸皮膚或口腔.室內要通風良好，產生毒氣的操作應在通風廚內進行。毒物及廢液不得隨意亂倒。實驗室內嚴禁進食。七、實驗結束時，應將水、電、門窗關妥后，方能離開實驗室.八、實驗時一旦不慎起火，應沉著冷靜,積極滅火。首先立即切斷實驗室內所有電源及火源，搬走易燃易爆物品,同時針對起火點情況,選用適當滅火器材進行滅火.九、急救常識。(一）外傷：及時取出傷口中的碎玻璃屑或固體物質，用蒸餾水沖洗后涂上紅藥水,用消毒紗布包扎。大傷口則先按緊主血管,急送醫(yī)院治療。（二)火傷：輕傷可在傷面涂以硼酸凡士林。重傷則須請醫(yī)生診治.（三）試劑灼傷:1．酸灼傷:立即用大量水沖洗,然后用3%碳酸氫鈉溶液蘸洗。2。堿灼傷:立即用大量水沖洗,然后用１％醋酸溶液蘸洗。

實驗一薄層板的制備、活度測定及薄層層析、紙層析的應用實驗的目的要求：掌握ＴLC、PＣ的原理。掌握薄層層析板的制備及薄層層析、紙層析操作的基本方法。了解展開劑、吸附劑的選擇以及與被分離物質的關系。應用薄層層析法、紙層析法檢識中藥草中的化學成分。層析分類與應用概述中草藥的研究、鑒定工作中，對探討中草藥中含有哪些化學成分，如何將中草藥中的有效成分提取、分離、精制，并鑒定結晶純度等等.除常用的經典方法外,仍因中草藥中化學成分復雜，許多成分結構類似，有效成分含量極少，僅僅采用經典方法往往難以達到分離的目的,所以必須配合各種近代的分離方法，其中常用分離效率高、操作較簡便的層析分離法(Chroｍatｏgｒａｐhｙ）。由于有效成分的類型不同、性質不同，因此選擇層析法的種類也不同.可參閱教科書第二章第二節(jié)層析法的內容.本實驗著重介紹薄層層析法（Thiｎ－LayerＣhromａt(yī)ｏgrap-hｙ，TＬC）以及紙層析法(PａｐerChｒoｍaｔogｒap、ＰC）的應用.這些方法主要用于選擇粗提取物的分離條件;化合物純度的鑒定；制備一定量的某些化合物；或在薄層選用不同配比的混合溶劑。吸附層析主要考慮的是展開劑的極性；但被分離物質在展開劑中的溶解度也要影響到它的層析行為.在一種吸附上用多種展開劑試驗后如果分離不成功，可改用另一種吸附劑來試驗。分離的化合物在板上的比移值(Rｆ）在0.2-0.8之間為好。二組分之間Rf差值＞0．0５，以免斑點重疊。（展開劑選用舉例見教科書第19頁表2－8)。在吸附層析中，吸附劑的活度,展開劑的極性，被分離物質的極性，是層析條件三要素,這三者的關系是相互聯(lián)系的，見圖。當A指向中極性物質時,則B就指向選用中等活度的吸附劑，Ｃ就指向選用中等極性的展開劑。如分別轉到A'Ｂ'C＇的位置，則又是另一種情況。分配薄層層析—有些強極性化合物，能被吸附劑強烈吸附,用洗脫能力很強的溶劑仍很難推動。這時就必須選用分配層析。它是利用被分離物質在兩相中（如水和非極性有機溶劑中）分配系數(shù)的不同而達到分離的目的.分配薄層層析常用的擔體有硅膠、硅藻土、纖維素等。選擇展開劑的根據(jù)是被分離的物質在展開劑（固定相、流動相）中的溶解度相差最大的溶劑組成不同的比例，為首用試劑?；衔镌诹鲃酉嘀械娜芙舛扔?，則它在分配層上移動得愈遠，比移值就愈大。流動相應先用固定相飽和，固定相種類有水、不同PH的緩沖溶液、親水有機相(甲酰胺、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇等)。流動相為含固定相(常用如水）的有機溶劑，有時為了防止弱酸、弱堿的解離,加入少量的酸和堿.薄層層析展開后的斑點檢出，通常先在可見光下觀察,劃出有色物質的斑點位置，然后在紫外光分析燈下觀察有無吸收或熒光斑點,并記錄其顏色、位置及強弱，最后利用各化合物的特性反應，用噴霧器均勻地噴灑適當?shù)娘@色劑，使層析譜顯色。各類化合物所用的顯色劑見附錄4。絡合薄層層析-在絡合劑處理的吸附劑上進行吸附薄層層析行為時,不飽和化合物（絡合物的供體）與絡合劑（金屬離子既絡合物的受體）形成π絡合物。 在層析時可按照被分離的化合物不飽和度的位置、幾何異構等情況，所形成絡合物的絡合強度不一，導致比值不同達到相互分離的目的.飽和脂肪酸不與受體絡合,推向薄層的最前沿;含雙鍵的比含三鍵的吸附牢；末端雙鍵或環(huán)外雙鍵比不是這種類型的吸附牢.由于硝酸銀的存在影響一些顯色劑的靈敏度,如碘蒸氣很少用于該法的顯色.有關絡合層析各類化合物的溶劑系統(tǒng)及顯色劑見附錄４.一般操作技術（一）薄層層析薄層板的制備1.不加粘合劑的薄層板涂布法氧化鋁薄層將吸附劑置于薄層涂布器中，調節(jié)涂布器的高度，向前推動,即得均勻薄層。本實驗主要用下述簡易操作涂布薄層,取表面光滑，直徑均一的玻璃棒一支，依據(jù)所制備薄層的寬度、厚度要求,在玻璃棒套上厚度為0。3-1mｍ的塑料圈或金屬環(huán)，以使玻璃棒向前推動時能保持平行方向,操作時，將氧化鋁粉均勻地鋪在玻璃板上，按下圖所示方式推動。22413(2）纖維素薄層，一般取纖維素粉1份加水約5份，在研缸中混合均勻后,倒在玻璃板上,輕輕振動，使涂布均勻，水平放置,待水分蒸發(fā)至近干，于１00２℃干燥30-60分鐘即得。(3）聚酰胺薄層,取錦綸絲（無色干凈廢絲即可）用乙醇加熱浸泡2-３次,除去蠟質等。稱取洗凈得錦綸絲1g，加85%甲酸5ml,在水浴上加熱使溶,再加７0%乙醇6ml，繼續(xù)加熱使完全溶解成透明膠狀溶液.將此溶液適量倒在水平放置的、用清潔液洗凈的玻璃片上，并自然向周圍攤勻,厚度約為0.3mm,薄層太厚時,干后會裂開.將鋪好的薄層水平放在盛溫水的盤上，使盤中的水蒸氣能熏濕薄層,盤子加玻璃板蓋嚴密。薄層放置1小時完全固化變不透明白色,再放數(shù)小時后，再泡在流水中洗去甲酸，先在空氣中晾干，后在烘箱中80℃恒溫加熱活化15２。加粘合劑薄層的涂布法（１）硅膠G薄層,取硅膠G或硅膠GF1份，置研缽中加水約5份,研磨均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中，推動涂布）均勻涂布成0。２5－0.5ｍm厚度，輕輕震動下玻璃板,使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中110℃烘干活化1-2（2)硅膠（Ｈ）羧甲基纖維素（CＭC—Na）薄層，取羧甲基纖維素０。2g,溶于２5mｌ水中，在水浴上加熱攪拌，使完全溶解，倒入研缽中加硅膠細粉(一般硅膠細粉過300目篩的，約6-８g,過２００目篩的，約需１0-20g，）研磨成稀糊,照硅膠G薄層涂布法制備薄層?；蛉。矇K2。5mm厚度的玻璃長板，中間夾一至幾塊2．2mm厚的薄層用玻璃片，將適量硅膠糊倒在中間,用藥匙適當涂勻，另取一塊邊緣較平整的玻璃片將硅膠糊刮平，推出薄層板，水平放置，自然晾干后再活化貯存。氧化鋁G薄層、氧化鋁羧甲基纖維素鈉薄層的制備方法同上，一般所需氧化鋁量比硅膠稍多。硅膠燒結薄層采用硅膠細粉混合一定量的玻璃細粉,涂布在玻璃板上，在高溫下將薄層燒結在玻璃板上，一般薄層厚度0．25mm,薄層用后經過處理，可以多次重復使用.3．特制薄層的制備根據(jù)分離工作的特殊需要,可制成以下幾種特制薄層。（1)酸、堿薄層和PH緩沖薄層為了改變吸附劑的酸堿性，以改進分離效果,可在吸附劑中加入稀酸溶液（如0．1N-0．2N草酸溶液）代替水制成酸性氧化鋁薄層使用.硅膠微呈酸性，可在鋪層時用稀堿溶液（如0.１N—0.5N氫氧化鈉溶液）代替水制成堿性的硅膠薄層.當用乙酸鈉,磷酸鹽等不同PH的緩沖薄層。（２)絡合薄層硝酸銀薄層的制法，可在吸附劑中加入5—25％硝酸銀水溶液代替水制成均勻糊狀,在按常法鋪成薄層。制成薄層避光陰干,于10５℃也可先把硝酸銀用少量水溶解，再用甲醇稀釋成10%溶液。把預先制好的硅膠Ｇ薄層浸入此溶液中約1分鐘，取出避光陰干按上法活化、貯存。（二）點樣將樣品溶液滴到已制備好的薄層上，點的直徑不大于2－3mm,樣品滴加在距離薄層一端1－1．5cm的起始線上,點與點之間距離0．5—１cｍ，展開劑用量以浸沒薄層起始線這邊約為0.5cｍ的高度的量。一般定性時可用普通毛細管，定量可用微量注射器（1、10、５0μl）。樣品溶液應盡量選用易揮發(fā)的有機溶劑,以便點樣后溶劑迅速揮發(fā)，以減少空氣中水分對吸附劑活度的影響。如果樣品為水溶液或不易揮發(fā)的溶劑,此時可用電吹風或紅外燈加熱，要注意遇熱不要破壞化合物。點樣量一般為幾到幾十微克。斑點要集中,所以點樣時應點在原點上，直徑要小。（三）展開劑選擇的方法前面已提到選擇展開劑的原則。在實際工作中大都還要經過實驗而確定合適的展開劑。微量圓球技術(見柱層析)可對吸附薄層的展開劑進行初選。好的展開劑應要求是能把混合物的成分很好的分離。展開劑的質量對于展開結果的影響較大.溶劑要用三級（CＰ)或二級(ＡR）純規(guī)則的溶劑?；驅⒐I(yè)級的溶劑精制后應用。薄層的展開必須在一個密閉的層析缸中進行。層析缸內預先用展開劑蒸氣飽和,飽和后才能進行展開.實際應用小層析缸時由于空間較小很快達到了飽和，同時展開時間短,對分離效果影響較小.邊緣效應不明顯.常用溶劑性質表(附錄３）、共沸混合溶劑表(附錄5)。供選擇展開劑時參考.展開方式最常用的是上行法,它比下行法分離效果好,因展開劑移得較慢,除了單向展開外，由于單向展開第一次展開后幾種成分分離得不太開，經過第二次轉向展開后,就有可能分得更開些。對成分復雜和化學結構相近的混合物，常用這種雙向展開法來分離.展開時一般在室溫進行。當被分離物質見光易分解,則應用黑布（紙)罩上避光展開。展開完畢后，取出薄層板，用鉛筆或小針劃出展開劑的前沿位置，待展開劑揮散后進行斑點檢出?！燃谆w維素鈉的溶液一般用０。5－1％濃度，宜預先配制后靜置，取其上層澄清溶液應用，則所制備的薄層表面較為細膩平滑。鑒定未知成分時是用已知的標準品對照,書本上常見的Rf值都是多次實驗的平均值,只有在基本相同的實驗條件下進行層析,才能得到相近的Rf值。書本上的Rf值可以作為一系列化合物在薄層上的相應位置以及它們之間分離的難易程度的參考.（四)氧化鋁、硅膠活度的測定1．氧化鋁活度的測定：一般可用4-５種偶氮染料以薄層層析法進行測定.（1)染料試劑的配制取偶氮苯（Azobenzene)6０mg,對甲氧基偶氮苯（Pnethoｘyａzｏbenzene），蘇丹黃(SｕｔｄanIBeneｎe—ａｚo－β—naphｔhoｌ）,蘇丹紅（SuｄanⅢTｅｔrazｏ—beｎzｏｌ-β-ｎaphtheｌ），對氨基偶氮苯（P—Amｉnc-azcbeｎｚｅne)各40ｍｇ,分別溶于１00ml重蒸的四氯化碳中。實驗方法常用制備氧化鋁薄層，以鉛筆尖或毛細管尖在薄層板一端2—3cm處間隔１cｍ左右點上5個可以看清的小點，各吸取約0.02ｍl染料試劑分別點滴于原點上，以四氯化碳為展開劑,展開時薄層板與容器底部交角為10－40°研究空間。展開后測出各斑點的Ｒｆ值，從表Ⅰ確定氧化鋁活度（一般高活度氧化鋁使用本法時，結果往往偏低）。另取氧化鋁薄層板一塊,置于水蒸氣飽和的容器２、3小時后取出，按下述方法測定活度，觀察有無變化.表1氧化鋁活度與偶氮染料Rf值關系偶氮染料氧化鋁活度純Rｆ值Ⅱ級Ⅲ級Ⅳ級Ⅴ級偶氮苯0.５９0.7４0.8５0。９5對甲氨基偶氮苯０。160。490。６90.89蘇丹黃0．010．２50．５70。78蘇丹紅0.000．100.53０．5０對氨基偶氮苯0。０００。０３0。080.１92.硅膠活度的測定一般選用三種染料，用薄層層析法進行測定.歐洲藥典19６9年記載用0.01%二甲基黃（Meｔhyl－yelｌow,Ｐ－Ｄimetｈylamｉｎoａzobｅnzene）,蘇丹紅(SudanⅢ），靛酚蘭（Indophenｏｌｂlｕe,1,4-Ｎaｐｈoqｕｉnonｅ—4－Naｐｈｔhｏq-unione－4-dｉｍethｙlaｍｉnｅaniｌｉnｅ）的苯溶液各10μｌ，點滴于硅膠G或硅膠H薄層上，以苯為展開劑，展開1０cｍ(約2０分鐘）,三種染料應明顯分離。靛酚蘭斑點接近于起始線，二甲基黃斑點在薄層的當中,蘇丹紅斑點在靛酚蘭斑點與二甲基黃斑點之間，則認為薄層板活性符合要求。3。毛細管測定氧化鋁、硅膠活度的測定法取1.0×７５mm的毛細管，將毛細管的一端封閉,另一端開口，另取一個滴帽在底部打個小洞，將毛細管開口端穿入滴帽內部,然后將滴帽內充滿吸附劑，輕輕拍打滴帽，使毛細管很快充滿吸附劑（或似裝測熔點法加入吸附劑），滴一滴苯在毛細管開口端（目的防止吸附劑從毛細管中掉出來），將毛細管倒轉，并切掉封尾端，濕端以0．５％適當染料的苯溶液中沾一下，直至一滴染料溶液被吸附，然后將毛細管放入含有幾毫升的苯溶液中，展開計算Rf值，從表中查出活性級別。染料對氨基偶氮苯(Ｐ—Amiｎc—aｚcbenzｅne）用于氧化鋁對二氨甲基偶氮苯(Ｐ－diｍethyl—aminｃ—azcbenzene）用于硅酸。氧化鋁含水量(％)Ｒｆ值級別硅膠含水量(％）Ｒf值級別0３６８１0０0.１20.240。460.54ⅠⅡⅢⅣⅤ０３691215０.150.220.330.440。５50．66ⅠⅡⅢ國內青島海洋化工廠出售層析用的硅膠在吸附劑名稱之后加幾個字標明的意思是：硅膠G(G是Gypsu石膏的縮寫，表示加了石膏)、硅膠Ｈ(H表示不加石膏)、硅膠GF（GＦ表示加石膏和波長為25４nm顯綠色熒光的硅膠鋅錳)、硅膠GＦ（ＧF表示加石膏和波長為365nm顯黃色熒光的硫化鋅）。氧化鋁則類推.薄層層析應用實例(一）定性點滴反應1。樣品(1)氨基酸混合液(2）薄荷油(3）苦參乙醇液(4)蘆丁甲醇溶液甘草次酸乙醇液大黃乙醇液2。檢出試劑（1）三氯化鐵(2）氨性硝酸鹽（3)氫氧化鉀(４）茚三酮（５）碘化鉍鉀(７）香草醛—硫酸（應在薄層板或白磁板穴內進行）3.實驗方法取硅膠CMC－Nａ薄層板1－2塊或濾紙片一方條，用軟鉛筆按下圖劃線，將各樣品滴加于相應的格子中,再將各試劑分別自空白起逐格滴加試劑，觀察并記錄反應變化。具腐蝕性試劑也可用帶穴白磁板，有的檢出在試管中進行實驗。 試劑樣品（1)(２）(３)（４）（5)（6)（7）（1）（2)(３）(4）（二)鑒別中草藥中的化學成分單向展層例一（1）硅膠CMC－Na薄層（載玻片板)（2）樣品薄荷油薄荷腦的乙醇溶液（３）展開劑①石油醚②乙酸乙酯③石油醚—乙酸乙酯（85：１5）(４）顯色劑香草醛—硫酸※（壓板法)點樣展開后，稍干,反扣在一塊同樣大小并已涂布一層顯色劑的玻璃板上，稍稍轉一下,連玻璃片反轉,使薄層面向上，觀察顏色變化。由結果判斷何種展開劑最適合分離薄荷油。例二(1）硅膠CＭC—Na薄層（載玻片板）（2)樣品龍膽提取物（3）展開劑①石油醚②氯仿③甲醇④氯仿—丙酮(8:2）⑤氯仿—乙酸乙酯-甲醇—水(35:5：1０：0。5）（4)顯色UV2５4下觀察由展開結果判斷選用何種展開劑最為合適。香草醛—硫酸※為1g香草醛溶于100ml濃硫酸，或0.5ｇ香草醛溶于100ｍl硫酸—乙醇（４：1）中,噴灑時須加熱至120℃雙向展層ⅠⅠⅡ(１）硅膠ＣMC-Ｎａ薄層板（８×8cm）,不活化,在薄層板距兩邊各1.5ｃｍ交點的地方點樣品。（2）樣品混合氨基酸（精氨酸、脯氨酸、亮氨酸的1％水溶液）。（3）展開劑第Ⅰ向為正丁醇—醋酸-水(４：1：1）（V/Ｖ）第Ⅱ向為苯酚—水（75:25)(W／W）第Ⅰ向展開劑展層后，加熱風使溶劑揮發(fā),再將樣品已展層的一向作起始線,在第Ⅱ向溶劑系統(tǒng)中展層。（4）顯色劑０。2％茚三酮乙醇液,噴灑后,以電吹風加熱(６０℃—100℃3．硝酸銀—硅膠薄層（1)硝酸銀硅膠糊的制備:用20ｇ硅膠G和55ml水中含5g硝酸銀(８%）的溶液調制成，按常法鋪成板（4×7cm、約3０塊）。避光陰干后,于105℃（2)樣品轉化后的α—細辛醚粗品（３）展開劑環(huán)己烷-醋酸乙酯(1：1或7:3）（4)顯色點將薄層板展層后置紅外燈下加熱使其出現(xiàn)黑色斑點檢出。（三）原位反應薄層本法使直接在薄層上進行有機反應。先將樣品滴加在薄層板上，然后再滴上試劑進行反應，再用適當?shù)娜軇┱归_反應物.有時先在試管內進行反應。而后在薄層板上進行層析檢識.根據(jù)原來化合物的Rf值、再聯(lián)系反應產物的層析行為、Rf值,可供鑒別一個化合物或者提供鑒定一個化合物極有價值的線索.應用這些特殊反應只消耗未知物極微量的樣品卻提供了大量的有關結構鑒別的情報，操作簡單.如氧化、還原、脫水、水解、鹵代、酶的催化作用、酯化、硝化、衍生物的制備、混合反應等均可在薄層板上進行。1。酯化反應(1）取原兒茶酸乙醇溶液，在薄層上點加兩個相同樣點,其中一份點在原點上，再點加試劑:醋酐—吡啶（3：1），待溶劑揮散，再重復點加試劑幾次,干后，以氯仿—丙酮(8：2）展層，(用碘蒸氣熏顯色,可見其中點加醋酐吡啶試劑的樣點已展開在前,而未加試劑的樣點仍近起始線）。(2)取原兒茶酸乙醇溶液，在同一薄層上點加兩個相同樣點，其中一份樣點在原點上，再點加醋酐—吡啶(3：1），待試劑揮發(fā)后,再重復點加試劑數(shù)次，用氯仿—丙酮（8:2）展層。用２，4—二硝基苯肼顯色。2。成鹽反應取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層板上的起始線上點加兩個相同樣點，其中一份樣點在原點上，再點加1０%碳酸氫鈉溶液（另一份不加)，以氯仿—丙酮—甲醇（8:2：1）展層,并用三氯化鐵乙醇溶液噴霧顯色，可見其中點加碳酸氫鈉的樣點的Rf值已有明顯變化，未加堿的樣點照常展開。苯腙反應取原兒茶酸乙醇溶液,在同一薄層上點加兩個相同樣點，其中一份樣點在原點上，再點加2，4-二硝基苯肼試劑,給以熱風以促進成腙反應，然后以氯仿—丙酮（8：２)展層，可見出現(xiàn)兩個棕紅色斑點。在紅棕色斑點下，再噴以三氯化鐵試劑,又出現(xiàn)紫藍色斑點.上面的紅色斑點是原兒茶醛與2,4—二硝基苯肼所形成的,下面的紫藍色斑點是剩下的部分未成腙的原兒茶醛。由原位反應的結果判斷原來化合物的結構上有何基團特征？并繪出圖譜。紙層析原理、一般操作及運用紙層析是以濾紙為支持劑,樣品點樣后在固定相與流動相通過毛細現(xiàn)象向另一端展開。被分離物質在兩相間分配系數(shù)不同而達到分離的層析方法。展開劑選擇與分配薄層層析類似。被分離物質在展開劑系統(tǒng)中Ｒf值在0.０5—0。85之間，兩個化合物之間Rf值之差最好大于0.05。單個化合物的Rf值最好在0．4—0.６之間.一般操作按展開劑展開劑展開方向可分為上行、下行、徑向。上行法又分為單向、雙向。點樣用的毛細管應細些使點樣斑點呈小圓形，直徑在2-3ｍm.點樣濃度、數(shù)量不宜過大，防止斑點拉長、Ｒｆ值偏低。可用標本缸展開,必須使缸內為展開劑飽和后再將濾紙放入（展開劑用量以浸沒濾紙起始線一邊約為1ｃm高度的量）展開.展開完畢，取出，溶劑前沿用鉛筆劃線作記號,濾紙陰干后斑點檢測，除了不可用腐蝕性顯色劑外其余同薄層層析。應用在中草藥化學成分的定性點滴反應同薄層層析（腐蝕性酸不可在濾紙上檢出)苯胺—鄰苯二甲酸試液為苯胺0．93g和鄰苯二甲酸1.６6g溶于100ml正丁醇（用水飽和）中。鑒別中草藥中化學成分5%NaOH5％NaCＯ3／5%NaOＨPH９PH8ＰＨ５1。5cm2。0ｃm第一混合單糖的PC層析濾紙按纖維長絲方向（縱向）切成適當大小的紙條，在一端2cm處用鉛筆劃一條線為起始線,在起始線上點樣，點樣斑點直徑小于０.３cｍ，點之間間距1-1.５cm。（２)樣品：2。5%葡萄糖,鼠李糖混合水溶液。(３）展開劑:正丁醇-醋酸—水（4:１:1或４：1:5上層)。（4）顯色劑：鄰苯二甲酸—苯胺試劑，噴霧后于１0５℃,加熱10第二多緩沖液和堿液紙層析(１）緩沖濾紙的制備：取新華濾紙（３×１2cm)一張,距下端2cm處劃一起始線，向上每隔1。5cｍ劃一平行線按右圖在各條帶上涂布PH緩沖液和堿液，然后將其夾在兩片濾紙中吸至半干使?jié)駶欀笖?shù)為１。5（指濕濾紙為干濾紙重的1。5倍）備用。（2)樣品:大黃素，大黃素甲醚,蘆薈大黃素,大黃酸的氯仿溶液》（3）展開劑:氯仿（4）顯色劑:熒光檢出;氨熏（5）結果：記錄圖譜，并說明這些化合物酸度的強弱。涂緩沖溶液時,PＨ順序相反會怎樣？［附]PH緩沖溶液的配制：PH3：取0.2M磷酸氫二鈉溶液4.１ｍl加0.1M檸檬酸1５.89mｌ配成.PH５:?。啊?M磷酸氫二鈉溶液１0．30ｍｌ加0。1Ｍ檸檬酸9．7０ml配成。PH８:?。?２M磷酸氫二鈉溶液19。45ｍｌ加0.１Ｍ檸檬酸0。55mｌ配成。PＨ９。9：取0．1M碳酸鈉溶液5ml加0．1M碳酸氫鈉5ml配成。0。2M磷酸氫二鈉溶液含35。61g0．１M檸檬酸溶液含2１．０１g/L0.1M碳酸鈉溶液含2８.62g／Ｌ0。1M碳酸氫鈉溶液含８。40g六、參考文獻1、上海藥物研究所中草藥有效成分的提取和分離上海人民出版社2、中國醫(yī)科學院藥物研究所薄層層離及其在中草藥分析中的應用科學出版社3、北京醫(yī)學院等中草藥成分分析人民衛(wèi)生出版社?實驗二洋金花生物堿的提取分離洋金花又稱山茄花、曼佗羅花、馬蘭花等。洋金花為茄科曼佗羅屬植物白曼佗羅（Ｄａt(yī)uraｍｅｔelL)及毛曼佗羅（DｉnnoxiaＭiu）的花。所含成分主要有東莨菪堿、莨菪堿等.《本草綱目》中記載：諸風及寒濕腳氣,煎湯洗之。又主驚厥及脫肛,并入麻藥?，F(xiàn)代民間用于止咳平喘、解痙止痛作用,還用于外科手術麻醉劑。實驗的目的要求1。掌握莨菪堿、東莨菪堿的提取分離方法。2.掌握生物堿的一般理化性質及其結構與性質的關系。３.掌握生物堿及其鹽類溶解度規(guī)律及其應用。掌握反流分布法(CCD）的原理及基本操作。掌握紙層析及沉淀反應在生物堿檢識中的應用。洋金花中已知成分的理化性質1。東莨菪堿(Scoｐoｌamｉne、Hyosｉne）為黏稠的液體,其一分子水合物為針狀結構，熔點５9℃，溶于冷水(1：95），易溶于熱水、乙醇、乙醚、氯仿或酮中，難溶于苯、石油醚中。堿性較弱,Pkａ=７。502.莨菪堿(Ｈyoscyamine)為四角針晶,熔點108。5℃,[α]－2１0°（乙醇）難溶于堿水（1:２81)，能溶于苯（1：1５0）、醚(1:6９），易溶于氯仿（1：1）及醇和稀酸中。莨菪堿在光、熱和堿的作用下，易消旋化成阿托品。與酸水或堿水共熱時，則極易水解，生成莨菪醇和(一）莨菪酸.生物堿的提取分離1。原理利用脂溶性生物堿在酸性條件下成鹽后，溶于水不溶于極性小的有機溶劑,在堿性條件下成游離生物堿,溶于極性小的有機溶劑，不溶于水，反復處理，籍以使脂溶性的莨菪堿和東莨菪堿與雜質分開。2。工藝洋金花（磋碎)1０g置１00ml燒杯中，加水8０ml，用濃鹽酸調PH為２左右，浸泡24小時，過濾。濾液留5—７ml（A）做生物堿沉淀反應用濃氨水堿化至ＰH8-9,分別用氯仿20、15、1５ｍｌ振搖提取三次。?氯仿液水液留取15ml（B）供層析用其余氯仿液回收氯仿?總堿（Ｃ)注：［1］PH8－９足可以使莨菪堿和東莨菪堿游離，切不可使PＨ值過高,以盡量減少生物堿的水解速度.此步操作最好是先將溶液和氯仿加入分液漏斗中,然后再堿化，振搖，以減少生物堿在堿水中的停留時間.［2］振搖時注意防止乳化，不宜做猛烈振搖，以適度旋轉式萃取為以宜，一旦乳化，可用加熱或用玻璃棒摩擦容器內壁，以破壞乳化層,［3]所得總堿（C）用5ｍl氯仿(預先已用PH6．５緩沖液飽和）分次沖洗轉移到小錐形瓶中,供分離用。3。莨菪堿和東莨菪堿的分離（１)分離條件的考察取一條15×５cｍ層析濾紙，用鉛筆劃出起××××始線（距底端２ｃm)、垂直于起始線再劃三條縱線，將濾紙分四等分（如圖2－1)。用棉球蘸取不同的ＰH緩沖液，依次(按PH５、6。5、7．5、9)的順序,涂布于濾紙條帶上,涂布操作要求均勻、快速、盡量減少緩沖液向鄰近區(qū)間擴散.涂畢，將濕濾紙夾于兩張干濾紙之間,吸取多余的水分。然后用毛細管取總堿溶液圖2－１(Ｂ)，點于各條的原點處以水飽和過的氯仿展開5—10cm,取出，以改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色。記錄各種PＨ條件下的Rf值，并據(jù)此選擇圖2－１分離這兩種生物堿的適宜PH值。(２)CCD法操作方法取三支小分液漏斗,分別編號，每只內盛PH6.5的緩沖溶液或PH6。5的水（它們要和流動相相互飽和）5ｍl,然后將總堿(C)的氯仿溶液5ml轉入第一個分液漏斗中，振搖，分層,然后將氯仿層再轉移到第二部分分液漏斗中，此時，第一個分液漏斗加入新的流動相氯仿（用緩沖溶液飽和過的）。二個漏斗分別振搖,分層轉移。分別將第一、二漏斗中的流動相轉移到第二、三個漏斗中，那么第一個漏斗中再加新的流動相氯仿5mｌ，再振搖，如此完成了CＤD基本操作。以后的操作繼續(xù)同上轉移，但在第一個漏斗中不再加入新的流動相。從第三個分液漏斗轉移出的流動相放入收集瓶中，如此進行三次，即可得到三個氯仿相及三個水相.流動相（氯仿）（分液漏斗)固定相(PH6.５緩沖液）收集瓶圖２圖２—2四。生物堿的檢識１。生物堿的沉淀反應取洋金花酸水液(A)每份1ｍl,置于試管中,分別滴加下列各試劑2—4滴，觀察并記錄有無沉淀產生及顏色變化。(1）碘化鉍鉀試劑（2）硅鎢酸試劑(3)苦味酸試劑(樣品液需調至中性）（4）鞣酸試劑2.薄層層析硅膠吸附劑—硅膠G薄板展開劑-氯仿：甲醇（8：2)樣品:３個水相,3個氯仿相，總生物堿（B）對照品：東莨菪堿氯仿液莨菪堿氯仿液顯色劑：改良碘化鉍鉀記錄:薄層層析圖譜，并根據(jù)實驗結果說明：總堿中含有何種生物堿，哪種含量高些?CCD法中東莨菪堿和莨菪堿各集中于哪些符號中？該分離結果與其紙層析值的大小有何相關性？五。預習要求及思考題:１．預習要求充分預習實驗提綱,領會各項實驗內容的操作方法及其原理，并能初步判斷其可能出現(xiàn)的結果。結合教材有關內容：（1)生物堿及其鹽類溶解度的規(guī)律及其在提取分離工作中的應用,（2）CＣＤ法的原理及操作，它與PPC的關系。２。思考題（１）莨菪堿與東莨菪堿的堿性何者較強？試在理論上進行解釋，并提出實驗根據(jù)。（2)CCD法的基本原理是什么?怎樣加入樣品？怎樣轉移？怎樣鑒定分離結果？怎樣選擇適當?shù)腃CD條件（包括固定相和流動相）?（３)本實驗中用水提總堿時,為什么調PH2-3？用氯仿提總堿時為什么調PH8－9,分離總堿時為什么又調ＰH６.5?（4)生物堿沉淀反應時,應注意哪些事項？在下結論時應注意哪些問題？六、記錄及實驗報告１.記錄總堿的提取工藝(流程式）,總堿的沉淀反應現(xiàn)象及總堿的層析結果。2．記錄分離條件考察結果（繪層析圖），說明分離莨菪堿和東莨菪堿的最佳條件為何？３．記錄分離結果４.記錄在實驗操作中出現(xiàn)的異?，F(xiàn)象。

實驗三大黃中蒽醌類成分的提取、分離和鑒定大黃為蓼科植物掌葉大黃ＲheuｍPaｌmａｔclml,唐古特大黃R.tangutiumMaxim。etRegll及藥用大黃R．offｉcinalｅBａｉlｌ的干燥根及根莖。大黃中含有多種游離的羥基蒽醌類化合物及它們與糖結合成的甙.其中主要有大黃酸（Ｒhein）、大黃素(Eｍoｄｉn)，蘆薈大黃素（Ａloｅ—eｍodｉn）、大黃素甲醚(Physciｏn）、大黃酚（Cｈrｙso—phanaｌ）。大黃記載于《神農本草經》等許多文獻中，用于瀉下、健胃、清熱、解毒等。一、實驗目的要求1。學習緩沖紙層析的基本操作技術，并能根據(jù)紙層析結果，設計液—液萃取法分離混合物的實驗方案。2．掌握ＰH梯度萃取法的原理及操作技術。3。學習蒽醌類化合物的鑒定方法。二、大黃中已知主要成分的理化性質名稱晶形熔點－H-CＯＯH大黃酸（Ｒhein)黃色針晶３1８-320—ＣＨ—ＯH大黃素（Ｅmodiｎ)橙色針晶２56-25７-H蘆薈大黃素(Aloe－emodｉn)橙色細針晶21６－220-CH大黃素甲醚（Ｐhyscion)磚紅色針晶207-H大黃酚(Ｃhrysｏ—phaｎal)金色片狀細晶196大黃中蒽醌甙元，其結構不同,因而酸性強弱不同。大黃酸聯(lián)有,酸性最強；大黃素聯(lián)有β，酸性第二；蘆薈大黃素聯(lián)有,酸性第三；大黃素甲醚聯(lián)有，大黃酚聯(lián)有，該基團不為酸性基團，但因母核中具有１，8—二酚羥基,也具有一定的酸性,酸性第四。蒽醌類化合物在植物體內主要以甙的形式存在，有單糖甙，也有二糖甙。其中主要有大黃酸葡萄糖甙，大黃素－1-Ｏ—β—D葡萄糖甙、蘆薈大黃素ω—O—β-D葡萄糖甙、大黃酚雙葡萄糖甙，大黃素甲醚葡萄糖甙。此外,新鮮大黃中還有屬于雙蒽醌的番瀉甙Ａ及番瀉甙B等。本實驗先用酸水將蒽醌甙充分水解成總蒽醌甙元，再用不同PＨ緩沖紙層析為先導，選用適宜的不同的ＰＨ緩沖液分步萃取，以分離不同酸度的蒽醌甙元。三、大黃中蒽醌類成分的提取分離1。原理大黃中的蒽醌類成分大部分和糖結合，以蒽醌甙的形式存在于植物組織中,所以要用酸水水解使其生成甙元,蒽醌甙元可溶于苯，故用苯提取.2.工藝（1)大黃中總蒽醌甙元的提取大黃粗粉（10０g)?加20％30ml，苯４0ml，水浴回流2小時，用棉花過濾?殘渣 苯提取液(2)總蒽醌甙元分離方法的設計①大黃總蒽醌甙元的紙層析為了了解總蒽醌甙元所含成分，進行如下紙層析實驗取新華濾紙，距離下端2cｍ處劃一起始線,點加總提取液，用甲苯為展開劑上行展開，用０．5%醋酸鎂甲醇液噴霧，并在１00℃下加熱5分鐘顯色，結果如圖1。從圖1可以看出共有4個組分，經與標準品對照得知，Ｒf=0。96是大黃酚和大黃素甲醚的混合物；Rf＝0.7８是蘆薈大黃素；Rｆ=0。58是大黃素;Rf=0．１8②蒽醌類成分的緩沖紙層析實驗為了分離以上四種化合物，進行緩沖紙層析實驗，以確定最佳分離條件。緩沖濾紙制備：取新華濾紙,22×14cm離下端2cｍ處劃一起始線，再每隔1cｍ劃縱向平行線稱重,在每一條帶處順次涂布不同PH的緩沖液和堿液,涂完后，將濕濾紙夾在兩張濾紙中間,然后取出稱重,使其濕潤指數(shù)為1．5（即濕重為干重1．5倍）。在每一條帶原點處,點總蒽醌甙元提取液，用水飽和過的氯仿為展開劑上行展開，當展開劑上升至5－7cm時,取出,烘干，其結果如圖－２所示。在圖-2中，可以看到有三條“S"形曲線，其中Ⅰ為大黃酸；Ⅱ為大黃素；Ⅲ為蘆薈大黃素；余下的是大黃素甲醚和大黃酚的混合物.緩沖濾紙各條分別依次用下述緩沖液或堿液處理:1—ＰH3．2０,2—ＰH1。68,3—PH5。80,4—PH6．01，5-PH６。５5，6—PＨ7．１2，7-PH7.88（以上為檸檬酸—磷酸氫二鈉緩沖液），8—PＨ9.１8(硼酸緩沖液),9—5%，1０-PH9.9０,11—PH1０.50（10、11為-緩沖液），1２—0。5％，13—２．５％，1４-５%，15、１６、17分別為５％:5％（9：1,1：1，1:９），１8—5％水溶液.注:配好的緩沖溶液,用PH酸度計測定PH值。③最佳萃取劑的確定根據(jù)圖-2紙層析結果可以確定a。萃取大黃酸時以ＰH７.12緩沖液最為合適,因為在此條件下，總蒽醌中的大黃酸留在原點不動，而其它成分幾乎被推至前沿，說明大黃酸對PH7．１2緩沖液親合力強,在萃取時易轉溶于緩沖液中，其余成分對苯親合力大,萃取時仍留在苯液中，從而得到分離。b。萃取大黃素時,以PH9.９0緩沖液為宜，理由同上。c.萃取蘆薈大黃素時,則以5％:5％（9：1）為宜。d。大黃酚和大黃素甲醚留在苯母液中，可被5％提出。④各種萃取劑用量的計算確定a.分離組分Ⅰ（大黃酸)，PH7.1２緩沖液的用量計算如下：在PＨ7。12條帶處,Ⅰ號組分(大黃酸）=０。02，Ⅱ以上（其余甙元）＝0.90大黃酸的分配系數(shù):＝0。０1其余的甙元分配系數(shù)：=４．5由此計算容積比：分離因子：=4５0R=1/0．21說明在分離大黃酸時,苯總提取液與萃取劑的容積比應為1：０.21，又由于β值很大(450）,因此可做一次簡單萃取。ｂ．分離組分Ⅱ(大黃素）,PH=9。90緩沖液的用量計算如下:在PH9。９0條帶處，Ⅱ號組分（大黃素）,Ⅲ號以上成分大黃素的分配系數(shù):=0。０２其余的甙元分配系數(shù):=4.５由此計算容積比：分離因子:=225由此可知，用PＨ９．90緩沖液萃取大黃素時，用量應為苯萃取液的０.３倍，又由于β值很大（225)，因此可做一次簡單萃取。c。分離組分Ⅲ（蘆薈大黃素）,堿液用量計算如下:在5％:5％（9:１）條帶處：Ⅲ號組分(蘆薈大黃素）＝０.21Ⅳ號以上組分=0.９6蘆薈大黃素的分配系數(shù)：=0。1３1=１2由此計算容積比：分離因子:=９1。6由此可知，用5％：5％(9：1)的堿液萃取蘆薈大黃素時,用量應為苯總提取液的1.２5倍,又β〉50，仍做簡單萃取，（３)蒽醌類成分的分離和精制工藝苯總提取液(30mｌ)?加ＰH=7.１2緩沖液１5ml,振搖萃取一次。 緩沖液層（下層）? 苯層（上層）?加鹽酸酸化至 加PH=９.９0緩沖液20ml，ＰH＝３沉淀過濾?振搖萃取一次濾液 沉淀(Ⅰ）? 苯層 緩沖液層 干燥后用用5％KOH15ml?加鹽酸酸化至?２ｍl冰乙酸萃取2次?PH=3沉淀過濾?結晶 ??大黃酸?苯液 ?堿水層 ?濾液 ?沉淀（Ⅱ) (黃色針晶)??用少量?用鹽酸酸化?冰乙酸 至PH=3沉淀? 結晶 經磷酸氫鈣層析?過濾 大黃素 石油醚洗脫 (橙色結晶) 濾液?沉淀(Ⅲ）先流出部分?后流出部分 干燥后，用乙酸（大黃酚）?（大黃素甲醚) ?乙酯結晶?蘆薈大黃素 （黃色針晶）注：由于溫度對分配系數(shù)影響很大,所以最佳萃取劑的確定要以實驗溫度下紙層析結果為準，選擇和計算。一般萃取大黃酸時在PH7—8范圍,萃取大黃素則在PＨ9。5—11范圍內均可。2、操作方法ａ、大黃酸的分離與精制將含有總游離蒽醌的苯提取液移置２00ml的分液漏斗中，加7。１２緩沖液〉1５mｌ,充分振搖，靜置至徹底分層，放出苯液后,倒出緩沖液置燒瓶中,加HCＬ酸化至PH３，黃色沉淀析出完全后,過濾、沉淀、干燥,干燥后的樣品加少量醋酸加熱使其溶解，趁熱過濾，濾液靜置，析出黃色針晶為大黃酸，過濾得到純品,可供鑒定.ｂ.大黃素的分離與精制將提過大黃酸的苯液繼續(xù)移置分液漏斗中，用ＰH9．9緩沖液２１ml振搖萃取,徹底分層后,分出緩沖液層,用HＣL酸化至PH３，析出棕黃色沉淀，過濾,沉淀經干燥后，用少量冰醋酸加熱使其溶解，趁熱過濾,濾液靜置,析出橙色大針晶，過濾后,即得到大黃素純品，可供鑒定用。大黃素的結晶溶劑最好是吡啶，但因吡啶臭味難聞，故用冰醋酸。C、蘆薈大黃素的分離與精制余下苯液移置分液漏斗后,用5％Na2ＣO3：5%ＮaOH(9:1）堿水液８８ml分兩次萃取或用0．5％KOＨ88ml分兩次振搖萃取，分出堿水液加HCL酸化，析出的沉淀過濾干燥,用少量的乙酸乙酮結晶，得到黃色針晶的蘆薈大黃素純品，可供鑒定用.D、大黃酚和大黃素甲醚的分離—磷酸氫鈣柱層析(1）裝柱：取11５℃活化１0小時的磷酸氫鈣５ｇ放入100ｍl燒瓶中，加入一定體積的石油醚，攪拌均勻,取一潔凈的層析柱,底部放入一小塊脫脂紗布,松緊適宜,稍稍打開底部的螺旋夾，將伴有溶劑的CaＨP4（２）樣品上柱：將萃取后余下的氯仿液,回收至2-3ml，左右，過濾，濾液加適量的CaHP4拌勻,并于紅外燈下?lián)]散溶劑,然后加入層析柱的頂端，滴加石油醚,是樣品均勻濕潤，然后加少量CaHＰ４至柱頂，再加一小片濾紙至頂部，以防加入吸脫劑是將樣品沖起。(3）洗脫：由柱頂加入石油醚洗脫,先洗出的淺黃色流份為大黃酚,后流出的黃色流份為大黃素甲醚,分段手機，交叉段棄去.將收集的兩組溶劑回收至小體積時,可分別析出大黃酚,和大黃素甲醚，用乙酸乙酯結晶得到大黃酚的片狀結晶，供鑒定用.大黃素甲醚如混有大黃酚時，可多次重結晶,即可得到大黃素甲醚純品。［說明]1。進行洗脫操作時，應注意控制洗脫液的流速，如流速太快，難以建立平衡,太慢則譜帶容易擴散,都影響分離效果。2．應選用層析規(guī)格。四、蒽醌類成分的鑒定本實驗練習用ＰC的熔點及IR鑒定蒽醌類成分。1。紙層析鑒定取樣品的氯仿溶液，用新華濾紙上行展開,用０。5％的甲醇溶液噴霧,并在1０0℃下加熱5分鐘。展開劑:Ⅰ：石油醚（60℃-70℃Ⅱ：石油醚，以水飽和Ⅲ：丙酮：苯:水(3:4:2）取下層液.根據(jù)層析結果，初步判斷樣品的結構類型。［附注說明]紙層析對蒽醌類化合物的鑒定是很有幫助的。在不同溶劑系統(tǒng)中層析，并用堿或醋酸鎂等試劑顯色,根據(jù)Rf值的大小及斑點的色澤,可初步獲知蒽醌衍生物的結構概貌。尤其是對混合物中已知成分的鑒定(與標準品對照）。PC是一種簡單而迅速的手段.早已用于研究蒽醌衍生物在植物中的分布情況,并用于探討蒽醌成分與植物分類的相關性,即化學分類問題。（１）游離羥基蒽醌衍生物的紙層析,常用的展開劑有：①石油醚（６0℃-70℃②石油醚（４０℃-5０℃):丙酮:水（1:1③丙酮：苯：水(3:４:2），取下層溶劑.④石油醚(40℃⑤正丁醇,以２８%氨水飽和。⑥甲苯⑦苯,以97％甲醇飽和。（2)顯色劑:0.５%甲醇溶液噴霧，于１0０℃加熱顯色，或噴以5％氫氧化鈉溶液.（3）結構與Rｆ值的關系甲:用溶劑①展開時，蒽醌母核上的取代基種類，數(shù)目與Rｆ值的關系如下表所示：取代基數(shù)目取代基種類1234０.０00．01—0.070。07—0。5００.00—0．010.75左右0．０5－0。2３０.200。030．98０.980．９7—0。980。97由上表可知：a。α-OH蒽醌因與Ｃ=O形成分子氫鍵，故極性最小。Rｆ皆在0。97—0.98。b．促使蒽醌Rf降低的取代基，以降低程度大→小的順序排列為－COOH>－＞＞分子中只要有一個-COOＨ,Rｆ值即為0。０0，如大黃酸等。分子中只要有一個,會使Ｒf值降至0。07。如蘆薈大黃素。β—酚羥基也有較大極性,故β羥基蒽醌的Ｒｆ也明顯降低。當分子中有兩個β－OH時，Rf值可降至0附近。若分子中只有一個β-OＨ時，Rf值可降至０.0７-0.50左右，其中尤以鄰二羥基蒽醌的Rf值更低，間二羥基蒽醌Rf稍高。如：茜草素[1，２－２（OH）］Rf０。1７紫草素［１,２,4—3（OH）］Rf0.13大黃素［1，６,8－3(OH)－３—]Rf0.３0茜黃素[1,3－3（ＯH）-2—]Rf0.48α位的甲氧基對Rf值也有一定影響.如果分子中有四個α—甲氧基會使Rf降至0．０3左右，有二個α－甲氧基，Ｒf為0.05-０．28，只有一個α甲氧基，Ｒｆ為0。75左右。ｃ．甲基、β-甲氧基對Rf值影響較小。d。β－ＯH甲基化后，化合物的Ｒf值應升高；相反，α-OH甲基化后，蒽醌衍生物的Rf值則降低。乙：用溶劑系統(tǒng)③展開時，與①恰好相反,因為用的是下層水相溶劑,極性高。故極性強的化合物（含－COＯＨ及二個β－ＯH者)在本系統(tǒng)中得到展開并相互分離。含－CＯOＨ基者Rf0.6５以上，含雙β-OＨ者Rf0.4５左右。如：化合物溶劑系統(tǒng)①溶劑系統(tǒng)②大黃酸［1,8－2（OH)－3—COOH]0０.74大黃素［1,6，8-３(ＯH)－3-COOH]00.6５2，7－2(OＨ）-蒽醌00。452,３－2（ＯＨ）－蒽醌00。4６丙:溶劑系統(tǒng)④的極性最小，因此極性小的蒽醌衍生物（分子中只含α或β－OH、－及甲基的衍生物）可用本溶劑系統(tǒng)分離。例如大黃酚與大黃素甲醚在其它溶劑系統(tǒng)中是難以區(qū)分的,但在本溶劑系統(tǒng)中卻可以較好的分離?；衔锶軇┫到y(tǒng)①溶劑系統(tǒng)④溶劑系統(tǒng)⑥大黃酚[1，8-２（OH)—3-］0.980.950。９８大黃素甲醚[1,8-2（ＯＨ）—3-—6-］０。970.７８0．98丁:溶劑系統(tǒng)⑤可以分開有—CＯＯH,羥甲基、和β－ＯH、—OH的蒽醌。如：化合物溶劑系統(tǒng)⑤大黃素［１，6，８—3（OH)—3-］０。82蘆薈大黃素[1，8—2(OH）—3—］0.69大黃酸[１，８-２（OH）—3－COOH］0．40戊：溶劑系統(tǒng)⑥為單一的甲苯，使用方便，其層析規(guī)律與系統(tǒng)①相仿.但β—OH及—取代蒽醌的Rf值與①相互顛倒?；衔锶軇┫到y(tǒng)①溶劑系統(tǒng)⑥大黃酚［１，8—2(OH）－３-]0。980.98大黃素甲醚[1，８-2（OH）—3－－６—]0.9７0。６8蘆薈大黃素［１，８—2（OH)-3—］0。07０．65大黃素［１,６,8－3（OH）-3-］０.30０。40大黃酸[１，8—2（OH）-３－COOH]0.０0０．００蒽醌結構與Ｒｆ值的關系,除了上面所述的規(guī)律，還有許多人運用不同的溶劑系統(tǒng)做了大量的探討.其中尤以月田潔(藥學雜志，74,388，１9５４）的工作引人重視，他用多種溶劑系統(tǒng)測定了近2０種的蒽醌衍生物,并得出了結構與Rf值的關系,可供參考。2．熔點的測定:把重結晶后的純品，分別用裝有濃硫酸的b形熔點測定器進行熔點測定。大黃酸黃色針晶318－３20大黃素橙色針晶２5６-257蘆薈大黃素橙色細針晶216—220大黃素甲醚磚紅色針晶2０7大黃酚金色片狀結晶196ＩR光譜取檢品,用KBr壓片,測得其紅外光譜如圖：cmcm-1320028001700160013001100700400大黃酸的紅外光譜4000320016001400110080040040003200160014001100800400cm-1大黃素的紅外光譜cmcm-1320016001100800根據(jù)上面三張圖譜，判斷蒽醌的結構類型，特別注意Vc=o與結構的關系.具體解析參考教科書。大黃素甲醚、大黃酚的IＲ光譜從略.五、預習要求、思考題預習要求:ａ。初步掌握液、液萃取法選擇溶劑的理論及操作。b.預習實驗所用的方法及原理。2。實驗報告要求:記錄大黃總蒽醌的提取方法?？傒祯腜C檢查結果(附層析譜)總蒽醌的緩沖紙層析結果，并說明.它對總蒽醌分離方案設計有何意義?記錄總蒽醌的分離程序（包括溶劑用量)；記錄大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素的精制方法及PＣ和IR鑒定結果.3。思考題PＨ梯度萃取法的原理是什么？適用于哪些中草藥成分的分離?b．大黃種五種蒽醌類成分酸性和極性應如何排列？?實驗四蘆丁的提取、分離與鑒定蘆?。ǎ遥鮰im）亦稱蕓香甙（Rｕｔinoside），廣泛存在于植物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含蘆丁的植物至少70種以上，如煙花、槐花、蕎麥和蒲公英均含有，其中以槐米和蕎麥葉含量較高，可作為提取蘆丁的原料?；被紫盗浦参颯ophoｏｒaｊaponｉｃa的花蕾，自古作為止血藥.槐米中所含主要成分蕓香甙，又減少毛細血管的通透性作用。臨床主要用于防治高血壓病的輔助治療藥物。此外,蘆丁對于放射線傷害所引起的出血癥亦有一定作用。一、試驗目的要求1、以蘆丁為例學習黃酮類成分的提取分離方法。2、掌握黃酮類成分的主要性質及黃酮甙，甙元和糖部分的鑒定方法.３、掌握含羥基化合物進行以?；牟僮鞣椒?。4、通過槲皮素紫外吸收光譜的測定及應用化學位移試劑確定黃酮類羥基位置的方法。5、通過槲皮素與其五乙?；衔锏募t外光譜測定,確定該化合物的光能團，并與標準品圖譜對照。二、槐米中已知主要成分的理化性質槐花米中蘆丁的含量可高達２0%，另含少量皂甙.皂甙水解后，可得到華皮醇(Betｕｌｉn,C30H5０O２).

1、蘆?。ㄊ|香甙Ratiｎ)R=HR=H槲皮素R=蕓香糖蘆丁本品為淺黃色細小針狀結晶，含有3個結晶水熔點為1７7—178℃，無水物熔點190溶解度溶劑H2ＯMeＯHEtＯH吡啶熱１：2001：１0１:60易溶冷1:30001:１00１：6５01：1２易溶于熱水，難溶于冷水,溶于甲醇、乙醇，難溶于乙酸乙酯,丙酮；不溶于苯，乙醚、氯仿、石油醚等溶劑,易溶于堿液呈黃色,酸化后又析出。2、槲皮素(Quercetｉn）即蕓香甙元,為黃色結晶，Ｃ15Ｈ10Ｏ７.2H2Ｏ熔點３13-３14℃,無水物熔點31６℃。溶于熱乙醇（１:23）、冷乙醇（3、皂甙易溶于水、吡啶、能溶于甲醇。經酸水解后得到華皮醇及槐二醇，均溶于苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇中。三、白槐花米中提取蘆丁1、原理：黃酮類化合物結構中含有酚羥基，能與堿反應生成鹽而溶于水,溶液調至酸性后，又游離析出。此法為堿提—酸沉淀法，提取黃酮類成分常用的方法，此外，還可以采用水或醇的提取方法２、工藝注：[1]加入石灰乳即可達到堿溶解提取蘆丁的目的，還可以除去槐米中殘存的大量多糖類粘液質，但用量不宜過大,PH值不能過高，否則鈣能與蘆丁形成鰲和物而析出沉淀,此步為關鍵步，一定注意。［2]ＰH值過低會使蘆丁形成佯鹽而降低收率。［3］利用蘆丁在冷熱水中溶解度的差別來達到結晶目的。得到的沉淀要粗稱一下,按照蘆丁在熱水中1：200的溶解度加蒸餾水進行重結晶。蘆丁蘆丁石灰乳（大約1.5g左右）調至PH至8-9，加熱煮沸，保持30分鐘（注意維持PH8-9）趁熱過濾殘渣濾液在60-70℃濾液沉淀（粗制蘆?。┲亟Y晶將沉淀懸浮于蒸餾水中，加熱煮沸15分鐘后趁熱過濾殘渣濾液充分靜置，過濾60-70℃蘆?。ň破罚┧?、蘆丁的鑒定１、蘆丁的定性反應取蘆丁３-4mg，加乙醇5－6ml溶解,分成3分做下述試驗：（1）取上述溶液１－2ml,加２滴濃艷算，在酌加少許鎂粉，注意觀察顏色變化情況。（2)取上述溶液1－2ml,然后滴加2%的甲醇溶液，注意觀察顏色變化情況，在繼續(xù)向試管中加入２·檸檬酸的甲醇溶液，并詳細記錄顏色變化情況。［1](3）α—萘酚反應（Mｏlｉｓｈi'sReaction)取上述溶液1—2ｍｌ，然后再加等體積的10％α-萘酚乙醇溶液，搖勻,沿管壁滴加濃硫酸，注意觀察兩液界面產生的顏色變化。注：［1］在樣品溶液中加入20％ＺrＯCl2的甲醇溶液之后，如溶液呈黃色示可能有C３-OH或C5-OＨ。如再加入2％檸檬酸甲醇溶液,黃色不褪示有C3—ＯH;如黃色退去,加水稀釋后轉為無色,示無C3－ＯH但有C5－OH。（上述兩種條件下生成的絡合物因對酸的穩(wěn)定性不同,其中Ｃ３－ＯH，４-酮基絡合物的穩(wěn)定性）C５－OH，4-酮基絡合物的穩(wěn)定性)。２、蘆丁的紫外光譜解析取蘆丁溶于光譜純甲醇中,加入各種診斷試劑測定其UV光譜,如果入土6－１所示,試解析光譜并初步判斷其結果。200300400500λ200300400500λnmMeOH+AlCl3——MeOH+AlCl3/HCl…200300400500λnmMeOH+NaOAc——MeOH+NaOAc+H3BO3…蘆丁的UＶ圖，其數(shù)據(jù)如下ＭeOH２59266sh2９9ｓh3５9NａOMe272327410AｌＣl3２７530３sh４33AlＣl3/HＣL２713003６4sh4０2NａOAC27１32５3９3ＮaOAC／Ｈ3BO3262２983873、蘆丁的三甲基硅醚NＭＲ波普解析取蘆丁的三甲基硅醚衍生物30mg,溶于０。５CCＬ４中,測得NMR圖譜如下是分析其結構.（圖6-2）注:1）δ０.8（d，3Ｈ為鼠李糖末端甲基）2)δ3．0—4.0（m,10H，為鼠李糖基質子)３)δ4。２（S,1Ｈ為鼠李糖H-1)４）δ5.8（d1HJ=7H)為葡萄糖基H-１J=7H2說明Ciｌucose的結構型為B型５）δ6．1５（d1HＪ＝2H）與6。35(ｄ1HＪ=2H）構成A,B系統(tǒng)，分別為Ｈ－6,H—８６)δ6。9（d1HJ＝７H2)為Ｈ—５δ7。3（２Ｈ為H-６`H-2`(2）十乙酰化蘆丁的NMR光譜分析NMＲoｆTＭSEｔherofRｕtininＣＣl48.07.06.05.04.03.02.01.008.07.06.05.04.03.02.01.00H-6H-2H-5H-8H-6H-1H-2glusosylrhamnosyCH3rhamnosyRhamnoglusosylprotonsTMSＰPＭ（g)取精制蘆丁(不得混有甙元）1００ｍg置于5０ml干燥的錐形瓶中,然后加入少量無水吡啶（大約１—２ｍl)振瑤使之溶解。在冰水冷卻下滴加8－10lml醋酸酐，接上空氣冷凝管,水浴上加熱3０分鐘。放冷，再攪拌下將反應液頃入１０0mｌ冰水中，一直攪拌至油滴消失，白色沉淀析出為止。放置過夜,抽濾并洗滌沉淀，干燥后，將沉淀溶于少量95%乙醇中過濾，放冷，緩慢滴加蒸餾水數(shù)滴至剛剛混濁為止.然后加熱使之溶解,放置即得白色粉晶。（按同樣條件在重結晶一次）然后再槍式干燥器中干燥6小時即得蘆丁的乙?；衔铩Ｈ∩鲜鍪阴；J丁３0mg，溶于０。５mｌCDCl３中，以TMS為內標，測定NMR光譜(結果圖6－３）是與蘆丁三甲基硅醚衍生物的NMR進行比較,尤其要注意乙?；馁|子數(shù)目,借此判斷分制種ＯH的數(shù)目以及糖的數(shù)目。4、蘆丁水解后于甙元的鑒定（1）水解方法精密稱取蘆丁1ｇ(±0．3g），加1%硫酸３０ｍl，加熱40分鐘,放冷靜置過濾，所得沉淀用少量水洗滌出酸,干燥稱重,計算甙元于糖的重量比(1）,然后再用乙醇（95％大約１0ml）重結晶即得甙元。（母液可供做糖的紙層析鑒定）。8.07.06.05.04.03.02.01.008.07.06.05.04.03.02.01.00H-6H-2H-5’H-8H-6H-1,2,3,4–slucosylH-2,3,4-hamnosylH-2H–5,6(2protons)GlucosylH-S-rhamnosylrhamnosylCH3memonsylreduledspertomTMSＰPＭ（ｇ）(1)干燥稱重的甙元0．5g（次時干燥得的甙元含2個結晶水）。若按照甙元于糖的比例為１：2時；應得甙元的理論值為０。５086g。若在9５-97℃之間干燥則得脫水甙元的理論值為0.４５４g（2）甙元的鑒定通過甙元的化學講解，ＵV光譜以及以?；苌锏闹苽?檢識其結構。１）甙元的堿降解與降解產物的紙層析鑒定。++槲皮素間苯三酚原兒茶酸（ｑuerｃｅthn）(pｈｌoroｇlucｉnol）(proｔocａt(yī)e－ｃhｕriｃａciｄ）取甙元5０ml,加水和95％乙醇各5mｌ，以氫氧化鉀４g在石棉網上直火加熱回流5小時反映后揮去醇。然后，用稀鹽酸調成酸性(PH大約在2左右)用乙醚振瑤萃取，取醚層回收醚，殘液進行緩沖紙層析。然后用Sulphanilicacid（1)試劑顯色，并與間苯三酚和原兒茶酚的標準品對照層析結果如注（2）所示。注（1）SulphanilｉcaciｄT。S間苯三酚降解液原兒茶酚Ａ液：10%Nａ２CＯ３水溶液間苯三酚降解液原兒茶酚B液：0.5％SuｌphaｎilicaｃidC液：0．5％Na２CO3水溶液顯色程序：先噴A液,然后再噴B和Ｃ的等量混合液(B與Ｃ用時臨時混合)注（2)甙元堿降解產物的層析結果如圖所示（展開劑:水飽和正丁醇，濾紙,在展開前要用ＰH＝9的緩沖液處理）（圖6-4）２）甙元的ＵV光譜解析取甙元溶于甲醇中，加規(guī)定試劑（見附錄）測得UV光譜如下圖（圖6—5），判斷其結構。并根據(jù)甙元的UV光譜的差異判斷糖與甙元的聯(lián)結位置。200300400500λ200300400500λnmMeOH——MeOH+NaOMe…200300400500λnmMeOH+AlCl3MeOH+AlCl3+HCl…圖6-5其數(shù)據(jù)如下:甙元λmaｘaｍMｅOＨ255269sｈ301sh37０NaＭＥ2４7sh321(deｃ)AｌＣl３272304ｓｈ３3３4５8AｌＣl3／HCｌ26530１sｈ３5９428NaＯAc257sh２7４329390(dec）NaOＡc/Ｈ3ＢO3２613０3sｈ３88（程序Ⅲ）３)甙元乙?；锏娜埸c測定取甙元2０0mｇ,置于干燥的５０mｌ錐形瓶中,加５ｍl醋酐用滴管滴加濃硫酸1滴，振瑤是完全溶解，接上空氣冷凝管，水浴上加熱三十分鐘,放冷，在攪拌下將反應液頃入10０ml冰水中一直攪拌至油滴消失為止。抽濾并洗滌沉淀,干燥后以95％乙醇重結晶。測得甙元乙?；锏膍p于槲皮素五一?；锏娜埸c（１93℃)200300400500200300400500λnmMeOH+NaOAc——MeOH+NaOAc+H3BO3…（3)糖的鑒定將上得水解母液1０mｌ小心用Ｂa(OＨ）2（大約1－1。5g）細粉中和之中性,濾出生成的BaＳO４沉淀濾液小心濃縮至小體積（約１-2mｌ),此時注意防止炭火）取樣點于濾紙上,并用葡萄糖、鼠李糖標準品對照以正丁醇—醋酸－水(４:1：5）作徑向展開。顯色劑:鄰苯二甲酸苯胺，噴灑后在105℃下加熱３—５五、預習要求及思考題：（1)預習要求：1、掌握堿酸法提取蘆丁的原理及注意事項2、定性反應的反應機理3、了解黃酮類UV與ＮMR波譜特點4、乙?；磻膶嶒灧椒ǎ?）思考題１、蘆丁的提取工藝中影響產量和質量因素是什么?２、甙類結構的檢識大體程序如何3、甙類水解有幾種方法?４、怎樣證明蘆丁分子中只含有一個葡萄糖和一個鼠李糖?５、甙元的結構是怎樣確定的？6、怎樣證明蘆丁結構中糖基是聯(lián)結在3－O上?7、槲皮素乙?；苌锏闹苽鋺⒁馐裁?？六、紀錄及實驗報告１、詳細記錄定性反應結果2、繪制層析結果模擬圖并計算R值3、分析UV及NMR光譜4、分析討論試驗結果（成功、失敗原因)

實驗五人參皂甙的提取及甙元的分離鑒定人參為五加科（Ａｒaliaceaｅ）人參屬植物人參(Ｐａｎaxgin-seｎgＣ.A．Mｅyｅr）的干燥根，為我國特產名貴中藥.具有大補元氣、補脾益肺、固脫生津、安神益智的功效。主治虛咳喘促、食少倦怠、驚悸健忘、久虛不復等癥，療效顯著。有關人參化學成分的研究已有很多報道,近年來取得了較大進展。日本學者Sｈibata等從人參根中分離出10多種皂甙,命名為人參甙皂（genseｎoｓidｅ)Ｒ。Ra,和等,并測定了這些皂甙得化學結構.近年來對人參地上部分也進行了研究，葉、花、總皂甙中除了含有皂甙類成分外，還有黃酮類成分，主要為山奈酚（Kａｍpfｅrol）、三葉甙(Tｒifｅlin）和人參黃酮甙（Pａｎa－senｏsｉde）藥量及生化實驗證明，人參皂甙有人參相同的藥理作用，目前認為人參皂甙是人參中主要有效成分。人參中除含有多種人參皂甙外，還含有少量揮發(fā)油、脂肪油、膽堿、β谷甾醇、多種氨基酸和多種維生素等。人參皂甙的皂甙元有三種，即原人參二醇（Proｔｏpanaｘaｉol）、原人參三醇（Proｔoanａxｔｒiol）及齊墩果酸（Oｉeanolicacid）。前兩種皂甙元在水解過程中側鏈環(huán)合,故水解后實際得到的是人參二醇(Pａｎaxdｉol）及人參三醇（Pａnaxｔｒiol）。一、目的要求①通過實驗掌握人參皂甙的提取、精制方法,進一步鞏固和熟悉人參皂甙的性質。②熟悉和掌握人參皂甙的水解條件和方法。③熟悉和掌握柱層析分離人參皂甙元的原理方法及基本操作技術。二、人參中已知主要成分的理化性質人參皂甙：多數(shù)為白色無定形粉末或無色針狀結晶，味微甘苦，具有較強引濕性。易溶于水、甲醇、乙醇；可溶于正定醇和乙酸乙脂，不溶于乙醚、苯中。本品具有光學活性,在甲醇中多呈現(xiàn)右旋性。其水溶液經振蕩能產生持久泡沫。人參皂甙類一般對酸極不穩(wěn)定，通常在稀的礦酸中即可水解，生成三種皂甙元，即齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。各種主要單體人參皂甙的性狀及物理常數(shù)見表９－１表９-１10種人參皂甙的性狀及物理常數(shù)皂甙性狀（結晶溶劑)熔點(℃）甲醇分子式(結晶水)無色針晶(甲醇）2３9－241＋15。３3（0。9１)(2）白色粉末(乙醇:正定醇1:1５）197－19８＋12.12(０.91）(３）白色粉末（乙醇：正定醇1：５)22０-223＋3.０５（0。98）白色粉末(乙醇:正定醇1：５)199－20１—1．93(１.03７)(3)白色粉末（乙醇:正定醇１：1）2０6-209－19.３8(1.０3）無色針晶（50％乙醇)2０1—2０3－1．０0（１．００)白色粉末（丙酮)197-19８－６.９9（1.０0)無色甙水晶（正定醇－丁酮)194-196．5＋320（吡啶）（2）無色針晶（乙醇）18７－１8９-5.00-6．00（1．00)白色粉末(異丙醇）１８２－１8４+2１.00(１。01)三、人參中人參皂甙元的提取和甙元的分離鑒定１.原理:人參皂甙元與多個分子糖結合成甙，具有較強的親水性,易溶于水和低級醇類，實驗室采用熱水提取人參皂甙，提取液加堿（CaO）除雜。再用酸調至中性，上大孔樹脂柱，先用水洗去色素至無色，再用７0%的氨性醇洗至無色,人參皂甙便溶于乙醇洗脫，回收乙醇，便得到人參總皂甙。人參總皂甙和?。菴ｌ在醇液中進行溫和酸水解，可得到三種皂甙元，齊墩果酸、人參二醇和人參三醇。而不能得到原人參二醇和原人參三醇,這是因為在酸水解過程中側鏈的２0－位碳原子上的羥基(－OH）與該鏈上的雙鍵（C＝C)易閉環(huán),而形成帶有三甲基四氫吡喃環(huán)的人參二醇和人參三醇.水解后，除去醇、氯仿萃取物經硅膠柱層析分離即可得到三種單體皂甙元,經重結晶獲得純品,分別與已知皂甙的紅外光譜相一致.2．人參皂甙提取和甙元分離工藝流程①人參皂甙提取工藝:人參莖葉粗粉20g?熱水提取1小時,粗濾，（棉花）?提取液藥渣?加０。6ｇ是會乳沉淀，并調至PH9-10，放置10分鐘,抽濾 沉淀物 濾液?濃硫酸調PH7,放置１0分鐘。 中性提取液?回收后,上大孔樹脂柱,先用水洗至無色，再用?70%氨性醇洗至綠色。?乙醇洗脫液 回收乙醇 人參總皂甙（黃白色)人參皂甙元的水解和甙元的分離流程人參總皂甙 加含5%ＨCl的５０％乙醇液,加熱回流２小時 沉淀?水解液?（酸性皂甙元部分） ?加水稀釋，水浴蒸去醇,氯仿萃取?3次（1０，5，5ｍl） 水層?氯仿層 無水ＮaＳO干燥，回收氯仿?總皂甙元 少量苯溶解,硅膠柱?層析，用苯－乙酸乙脂?(8:２）洗脫組分Ⅰ組分Ⅱ組分Ⅲ ９5%乙醇重95％乙醇重 丙酮結晶 結晶3次 結晶3次?2次齊墩果酸?人參二醇 人參三醇mp299—30１℃?mp245-250℃操作方法（1）人參總皂甙的提?。喝∪藚⑶o葉粗粉２０ｇ，放入燒杯用熱水（80℃－９0℃）提取1小時，然后用棉花粗濾,在所得濾液中加入０.６g水石灰乳除雜并調PH9－10放置10分鐘左右，過濾，再將濾液用濃硫酸（少量）調ＰH7，放置10分鐘左右，回收提取液至少量（5—10mｌ)，再上大孔樹脂柱(注：此柱應提前洗好，清洗辦法略)先用蒸餾水洗至無色,再用（２）人參皂甙的水解稱取人參皂甙4－5g（不足時由老師提供），加２0倍量含５％HCl的50％乙醇溶液,加熱回流2小時，放冷，加0.5倍水,水浴去醇，轉入分液漏斗中，用氯仿萃取3此（1０，5，5mｌ），合并氯仿層，加少量無水硫酸鈉干燥，回收氯仿即得總皂甙元.（3)甙元柱層析分離稱取100－200目硅膠（105℃活化30分鐘）50g，用苯做洗脫劑濕法裝柱,柱頂放一層脫脂棉,壓上數(shù)個玻璃球，放出多余的苯（至高于吸附劑1ｃm），計算保留體積?？傇磉霸蒙倭勘饺芙馍现帽?乙酸乙脂（８：2）洗脫,薄層檢識(與甙元標準品對照）相同組分合并，回收溶劑。齊墩果酸、人參二醇用９５％乙醇重結晶,人參三醇用丙酮重結晶，純品８0注：由于人參花、葉中人參皂甙含量高且廉價,所以本實驗可用人參地上部分作原料進行實驗，脫脂3—4次，由綠變棕紅即可，其它操作同前。如果用人參根總皂甙元進行柱層析，要求學生精制人參二醇進行紅外光譜鑒定。若用人參花、葉總皂甙元進行柱層析分離，則要求學生精制人參三醇進行紅外光譜鑒定。四、人參皂甙的檢識(一）顯色反應1。醋酐—濃硫酸反應（Lｉｅｂｅrmamm-Bｕrｃhand反應）取人參皂甙樣品少許，溶于冰醋酸中，加醋酐—濃硫酸試劑（19:1)數(shù)滴,混勻,呈紅紫色.2。泡沫反應:取人參皂甙樣品少許于試管中，加水2-3ml溶解,密塞,用力振搖1分鐘，產生大量持久泡沫。(二）薄層層析1.人參皂甙TLC：吸附劑:硅膠G板展開劑：Ⅰ正定醇—乙酸乙脂—水(８:２：10）上層。Ⅱ氯仿-甲醇-水(13：7：2)下層。對照品:根、葉、花甲醇液（10mｇ/mｌ)顯色劑:10%乙醇液（V/V）,1１0℃加熱10分鐘，至棕紅色斑點出現(xiàn)。2．人參皂甙元TLC吸附劑:硅膠Ｇ板展開劑:苯—乙酸乙脂(１：1)對照品：人參二醇、人參三醇、齊墩果酸甲醇液顯色劑：同皂甙（三）光譜數(shù)據(jù)齊墩果酸：ＩR:330１，1700NMR（）δ：５。30,1.85，1.63，1.24，0.９1，0.７５人參二醇:ＩＲ:３301,1６26NMＲ（）δ:3。60,3.13，1。8８，1.6５，1。３3,0。９0人參三醇：IＲ：33４0,１617NMＲ(）δ:6．3２，4．60,3。６2,1．９5，１.60,1.3０,1．1