生物技術(shù)在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

生物技術(shù)在食品致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用第一頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三食品中致病微生物的檢測(cè)技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)運(yùn)用到有食品檢測(cè)方面，主要是針對(duì)一些有害微生物的核酸進(jìn)行研究通過(guò)核酸雜交和核酸合成等反應(yīng)快速檢測(cè)樣品中是否含有特定的有害微生物，并進(jìn)一步確定其含量，其中最主要的技術(shù)包括PCR技術(shù)、DNA探針技術(shù)和基因芯片技術(shù)。第二頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三1.聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）

（1）傳統(tǒng)PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreation,PCR)是1985年誕生的一項(xiàng)體外擴(kuò)增DNA的方法，是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。通過(guò)對(duì)人工難以培養(yǎng)的微生物相應(yīng)DNA或RNA片段的擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物含量，從而快速的對(duì)飼料中致病菌含量進(jìn)行檢測(cè)。第三頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三李秀娟等（2009年）對(duì)117株金黃色葡萄球菌的nuc片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序，結(jié)果顯示所建立的PCR方法能對(duì)117株金葡菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，焦磷酸測(cè)序結(jié)果的一致性進(jìn)一步驗(yàn)證了PCR擴(kuò)增結(jié)果的特異性，說(shuō)明該方法針對(duì)目前所用的研究菌株而言，尚未出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，具有較高的特異性。

第四頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺陷，例如只能定性而不能定量地檢測(cè)，且在有死細(xì)菌存在的情況下容易產(chǎn)生假陽(yáng)性、不能檢測(cè)致毒微生物產(chǎn)生的毒素等。隨著各項(xiàng)新技術(shù)的出現(xiàn)以及與PCR技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，發(fā)展起來(lái)了一系列改進(jìn)的PCR技術(shù)。目前應(yīng)用的方法主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR以及PCR聯(lián)合技術(shù)等。第五頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量的方法。該方法可以對(duì)GMO進(jìn)行定量分析，目前已被一些國(guó)家的政府實(shí)驗(yàn)室采用。第六頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三楊柳等（2011年）根據(jù)沙門氏菌fimY基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,采用基因重組技術(shù)構(gòu)建用于沙門氏菌檢測(cè)的定量標(biāo)準(zhǔn)品，成功構(gòu)建了沙門氏菌重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和沙門氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，具有較好的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。第七頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三多重PCR多重PCR是常規(guī)PCR方法的改進(jìn)，它是在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因序列。這種方法具有更大的可靠性和適應(yīng)性，并且能降低檢測(cè)成本。徐偉等（2009年）針對(duì)單增李斯特菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子基因prfA和志賀氏菌侵襲性質(zhì)?？乖璈基因ipaH設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR對(duì)兩種致病菌進(jìn)行同步鑒定，提供了一種快速且特異性高的同步檢測(cè)單增李斯特菌和志賀氏菌的方法。

第八頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三PCR聯(lián)合技術(shù)傳統(tǒng)PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出一些缺陷，采用一些新技術(shù)與PCR結(jié)合，對(duì)PCR技術(shù)的完善和發(fā)展提供了有力的支持，并應(yīng)用在致病菌檢測(cè)中。王永等（2009年)探討以16SrDNA保守區(qū)段為PCR擴(kuò)增對(duì)象，運(yùn)用SSCP技術(shù)對(duì)致瀉大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌以及蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，為食源性致病菌的快速鑒定提供方法依據(jù)。第九頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三劉成志等（2009年）根據(jù)志賀氏菌ipaH基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，篩選合適的DNA模板制備方法，采用快速常規(guī)PCR和定量實(shí)時(shí)PCR結(jié)合，對(duì)培養(yǎng)液中及乳飲料陽(yáng)性樣品中的志賀氏菌進(jìn)行檢測(cè)，建立乳飲料中快速檢測(cè)志賀氏菌的有效方法。楊大偉等（2011年）應(yīng)用PCR結(jié)合變性高效液相色譜(DHPLC)技術(shù)，以A型肉毒梭菌的A型肉毒神經(jīng)毒素基因作為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DHPLC技術(shù)進(jìn)行快速檢測(cè)，最低檢出限可達(dá)到為111ng/tube，該方法可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)A型肉毒梭菌。第十頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三2.核酸探針技術(shù)根據(jù)核酸探針中核苷酸成分的不同，可將其分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針，其中DNA探針是最常用的核酸探針。DNA探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù)，是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性，對(duì)某一特異性DNA序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。第十一頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三微生物經(jīng)過(guò)處理后固定于另一固相表面上,經(jīng)洗滌變性后加入DNA探針進(jìn)行雜交，DNA探針可以與同源性的靶DNA進(jìn)行互補(bǔ)性結(jié)合，依據(jù)指示劑選用合適的方法進(jìn)行檢測(cè)。目前，DNA探針技術(shù)已經(jīng)在沙門氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌及乙型肝炎病毒等檢測(cè)中得到了應(yīng)用。第十二頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三續(xù)文彬(2008年)針對(duì)單增李斯特氏菌hly部分基因設(shè)計(jì)探針，對(duì)腸炎沙門氏菌，大腸埃希氏菌，綠膿假單抱病菌，空腸/結(jié)腸彎曲桿菌等非單增李斯特氏菌經(jīng)雜交保護(hù)分析后，只有單增李斯特氏菌為陽(yáng)性結(jié)果，具有較好的特異性。薛力剛等（2010年）通過(guò)吖啶酯標(biāo)記核酸探針的方法檢測(cè)病原菌，核酸探針與待檢樣品中金黃色葡萄球菌的rRNA序列進(jìn)行雜交，形成穩(wěn)定的DNA:RNA雜交體，使用堿液破壞未雜交探針，在堿性過(guò)氧化氫中檢測(cè)發(fā)光。核酸探針法檢測(cè)金黃色葡萄球菌大大縮短了檢測(cè)周期，且特異性和敏感性較高，為金黃色葡萄球菌的鑒定提供了一種新方法。第十三頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三3.基因芯片技術(shù)基因芯片的主要原理是指將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面，微生物樣品DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針，然后再與芯片上寡核苷酸點(diǎn)雜交，最后通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度及分布確定檢測(cè)樣品中特定微生物的存在。與傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法相比，基因芯片技術(shù)先進(jìn)性主要體現(xiàn)在高通量檢測(cè)、簡(jiǎn)便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面的重大技術(shù)突破。第十四頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三

陳昱等(2009年)利用芯片技術(shù)對(duì)志賀氏菌等26株食源性微生物進(jìn)行檢測(cè)，最后成功建立了檢測(cè)和鑒定志賀氏菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157的方法，為3種食源性致病菌的快速檢測(cè)和鑒定提供了準(zhǔn)確、快速、靈敏的方法。賀晨等（2011年）篩選志賀氏菌、腸炎沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157等11種特異基因作為目的基因，建立了一種運(yùn)用多重PCR方法結(jié)合基因芯片技術(shù)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)11種常見致病菌的方法，為流行病學(xué)調(diào)查和傳染性疾病的早期診斷和判定提供了一種有效的檢測(cè)手段。第十五頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三

陸長(zhǎng)勇（2009年）針對(duì)金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等8種常見的食源性致病菌建立了基于單堿基延伸標(biāo)簽反應(yīng)原理的基因芯片檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)到0.1pg，以鼠傷寒沙門氏菌為單一檢測(cè)對(duì)象的細(xì)菌純培養(yǎng)物靈敏度可達(dá)到5×102CFU/mL。第十六頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三結(jié)語(yǔ)生物技術(shù)因其低成本、高效、高通量和高特異性等特點(diǎn)已經(jīng)滲透著食品檢測(cè)領(lǐng)域，其優(yōu)越性日趨明顯，成為未來(lái)食品安全檢測(cè)中的主力軍。但每種方法難免有其局限性，在應(yīng)用中需依具體需要進(jìn)行選擇或搭配使用，也期待各種方法的優(yōu)化和新技術(shù)新方法的問世，從而為人們賴以生活的食品提供安全和營(yíng)養(yǎng)的可靠保障。第十七頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三參考文獻(xiàn)[1]李秀娟,徐保紅,田會(huì)方等.基于PCR的金葡菌準(zhǔn)確檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2009,25(5):442-445.[2]楊柳,蘇明權(quán),馬越云等.熒光定量RT-PCR檢測(cè)沙門氏菌方法的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2011,15(1),17-20.[3]徐偉,劉軍,李素芳.單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR檢測(cè)技術(shù)的建立[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2009,9(1):201-207.[4]王永,趙新，蘭青闊，朱珠,程奕.4種食源性致病菌的PCR-SSCP檢測(cè)技術(shù)研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,15(1):13-15.[5]劉成志，錢凱，李潔莉等.乳飲料中志賀氏菌的快速PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J].研究報(bào)告,2009(1):1-5.第十八頁(yè)，共二十頁(yè)，編輯于2023年，星期三[6]楊大偉,劉云國(guó),譚樂義.食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC檢測(cè)方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2011(6):398-400.[7]續(xù)文彬.單增李斯特氏菌液相核酸探針檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2008,28-31.[8]薛力剛,劉金華,王全凱.金黃葡萄球菌核酸探針檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2010,23(1):91-94.[9]陳昱,潘迎捷,趙勇等.基因芯片技術(shù)檢測(cè)3種食源性致病微生物方法的建立[J].微生物學(xué)通報(bào),2009,36(2):285-291.[10]賀晨,孫鴻燕,邵麗筠等.